苍耳子治疗变应性鼻炎的网络药理学分析及作用机制研究

李丹，章秀梅，宣自华，刘丛彬，俞年军，2，3，谢冬梅，2，3*（.安徽中医药大学，合肥 23002；2.安徽省中医药科学院 中药资源保护与开发研究所，合肥 23002；3.中药研究与开发安徽省重点实验室，合肥 23002）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎，是特异性个体的鼻黏膜受到过敏原的刺激后，IgE 的介导功能被激活而引起的鼻腔慢性炎症性疾病。西医临床常用包括抗组胺药物、糖皮质激素、口服抗白三烯类等药物进行治疗，但是不同患者之间可能存在疗效差异，且对持续性AR 需维持治疗[1]，因此寻找疗效显著的中药显得尤为重要。

苍耳子（Xanthii Fructus）为菊科植物苍耳（Xanthium sibiricumPatr.）的干燥成熟带总苞的果实，具有散风寒、通鼻窍、祛风湿的功效[2]，为历代医家常用的鼻科要药。现代研究表明，苍耳子含有挥发油类、甾醇类、倍半萜内酯类、水溶性苷类、酚酸及其衍生物、黄酮类、蒽醌类等化合物[3-6]，其抗炎作用已得到相关学者的认可[7]。但是对苍耳子发挥抗炎活性的机制仍不清晰，因此本研究通过网络药理学对苍耳子治疗AR 的主要化学成分、作用靶点及信号通路进行了预测分析；同时，通过动物实验对预测得到的通路上的关键靶点进行检测，探究苍耳子治疗AR 的活性成分及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 数据库靶点筛选 查阅文献，并搜索中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，https：//tcmspw. com/index. php），整理数据库中苍耳子的全部成分。对搜索得到的化学成分保存后导入SwissADME 数据库中，进行预测分析确定出其作用靶点；按照Uniprot 编号，在Uniprot 数据库中查找对应的gene offical sympol 格式，将其作为靶点基因保存。

1.1.2 成分-炎症疾病的交集靶点分析 以“rhinitis”为关键词，在DisGeNET 相关的数据库中进行搜索，确定出可能的靶点，接着基于中位数筛选“Relevance score”值，在此基础上进行搜索得到满足相关要求的靶点信息。合并处理提取的信息，删除其中重复项后，将对应的靶点导入Venn 工具中进行绘图处理，从而确定出相关的交集靶点。

1.1.3 靶点的GO 及KEGG 通路富集分析 核心靶点确定后导入Metascape 数据库中，设定物种为“人类”，开展GO 生物功能富集处理，从而确定出生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）富集分析；KEGG 通路在富集研究时选择同样的数据库，将以上确定出的结果导入Cytoscape 3.5.1 中进行相关性分析，从而得到成分-靶点-通路网络图。

1.2 动物实验

1.2.1 仪器与试药 SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（ASPEN 公司）；RIPA 总蛋白裂解液、BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（ASPEN 公司）；ECL 化学发光检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；GAPDH 抗体（ab37168）（Abcam 公司）；PI3K 抗体（CST 4249）；Akt 抗体（CST 9272）；P-Akt抗体（CST 4060）；IL-4 ELISA 检测试剂盒（批号：05/2021）、IFN-γELISA 检测试剂盒（批号：05/2021）、IgE ELISA 检测试剂盒（批号：05/2021）（上海将来实业股份有限公司）。

1.2.2 动物 SPF 级健康SD 大鼠60 只，雌雄各半，体质量200 ～250 g [济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20190003]。

1.2.3 药物的制备 苍耳子药材购于安徽省亳州药材市场，经安徽中医药大学谢冬梅副教授鉴定为菊科植物苍耳（Xanthium sibiricumPatr.）成熟带总苞的果实。取苍耳子药材500 g，自然干燥后粉碎，参考文献中的煎煮法进行提取，获得苍耳子石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取部位[8]。

1.2.4 AR 模型大鼠的复制 参照课题组前期的造模方法[9]制备AR 大鼠模型。基础致敏阶段：以150 mg 鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）作为抗原，15 g 氢氧化铝粉末作为佐剂，两者共同混悬于50 mL 生理盐水中，作为致敏剂。采用腹腔注射的方法，每只大鼠注射致敏剂1 mL，隔日1次，共进行7 次基础致敏，用时14 d，正常组大鼠腹腔注射等容积的生理盐水。局部刺激阶段：第15 ～21日采用滴鼻法，以2% OVA 生理盐水溶液滴入大鼠两侧鼻孔，每侧50 μL，每日1 次，正常组大鼠以等容积的生理盐水进行滴鼻。造模成功后，需要以2%OVA 生理盐水溶液隔日滴鼻维持对鼻部的刺激以及过敏性症状直到实验结束。

1.2.5 实验分组与给药 将造模成功的大鼠重新随机分成模型组、氯雷他定组、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和总水提物组。各给药组大鼠通过灌胃分别给予相应的药物，每日1 次，共给药14 次。氯雷他定给药剂量为2 mg·kg-1；石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位受试物以及总水提物的给药剂量为5 g（生药）·kg-1，各组大鼠的给药体系均为1 mL/100 g。模型组和正常组大鼠灌胃给予等容积的生理盐水。

1.2.6 鼻黏膜组织病理观察 末次给药1 h 后，用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血后剥除上颌骨部的皮肤，取出整个鼻甲后放入4%甲醛固定，制作病理切片，在光学显微镜下观察、拍照、分析。

1.2.7 指标检测 末次给药1 h 后，用10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血5 ～10 mL，在离心管中静置2 h 后，3000 r·min-1离心10 min，收集血清，于-20℃冰箱中储存备用。检测前取出，室温下放置1 h 后按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，分别对大鼠血清中IgE、IL-4 和IFN-γ的含量进行检测。

1.2.8 Western blot 实验 取大鼠鼻腔黏膜组织，采用液氮研磨法，以1∶10 比例（0.1 g 组织∶1 mL裂解液）进行研磨，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用BCA 试剂盒进行蛋白定量。制备样品，采用SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒制备10%的分离胶和5%的浓缩胶，上样，电泳，PVDF 转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h 后加一抗，其中内参1∶5000，其他抗体1∶1000，过夜，TBST 冲洗3次，加入二抗1∶5000，TBST 冲洗3 次，ECL 发光液显影。

1.3 统计分析方法

在研究过程中基于SPSS 25.0 软件进行统计分析，同时利用GraphPad Prism6.0 软件工具进行绘图，连续变量用均数±标准差表示。组间结果差异进行单因素方差分析，计数数据通过百分比描述，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 成分库的构建与筛选 搜索苍耳子化学成分，共得到138 种化学成分，去掉无对应靶点的成分，共得到了23 个潜在有效成分，其中羧基苍术苷、洋蓟素（1，3-二咖啡酰奎宁酸）、N-反式-阿魏酰酪胺、噻嗪二酮在Uniprot 数据库中无对应靶点信息，故苍耳子最终得到19 个潜在有效成分，具体信息见表1。

表1 苍耳子潜在有效成分Tab 1 Potential active components inXanthii Fructus

2.1.2 化合物靶点的筛选 将搜集到的化学成分导入SwissADME 数据库（http：//www.swissadme.ch），对搜集到的苍耳子活性成分进行筛选，将筛选得到的化学结构式导入SwissTargetPrediction（www.sib.swiss）数据库，预测其作用靶点；按照Uniprot 编号，在Uniprot 数据库中查找对应的gene offical sympol 格式，将其作为靶点基因保存。将筛选的各活性成分化合物的靶点与疾病靶点进行对照，得到各个活性成分的潜在抗炎靶点基因，综合后获得217 个苍耳子潜在抗炎靶点基因。

2.1.3 成分-疾病的交集靶点分析 以“rhinitis”为关键词，在GeneCards 数据库中查询到有关疾病候选靶点10 275 个，通过“Relevance score”取中位数（n≥12.43），筛选得到2803 个相关疾病靶点。药物与疾病的交集靶点共108 个，提示这些靶点可能是苍耳子抗鼻炎作用的潜在靶点。

2.1.4 成分-疾病靶点的 GO 生物功能及 KEGG 信号通路富集分析 将得到的108 个核心靶点导入Metascape 数据库，物种选择为“人类”，共确定1859 个GO 条目（P＜0.01），其中BP 有1632 个条目，主要涉及白细胞迁移（leukocyte migration）、积极调控细胞迁移（positive regulation of cell migration）、对受伤的反应（response to wounding）、细胞对激素刺激的反应（cellular response tohormone stimulus）；CC 有99 个条目，主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、膜区域（membrane region）、溶酶体（lysosome）等；MF 有128 个条目，主要涉及蛋白激酶活性（protein kinase activity）、磷酸转移酶活性（phosphotransferase activity）、生长因子结合（growth factor binding）、受体配体活动（receptor ligand activity）。每项取P值前10 位条目，见图1。

图1 成分-疾病靶点的GO 生物功能富集分析Fig 1 GO biological enrichment analysis of component-disease targets

将比对得到的108 个核心靶点导入Metascape数据库，限定物种为“人类”，对其进行KEGG信号通路功能富集分析，共确定292 个条目（P＜0.01），根据-log10（P）值的大小取前20位KEGG 信号通路，见图2。主要涉及癌症通路、乙型肝炎、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、T 细胞受体信号通路等。以上通路表明，苍耳子活性成分与抗炎作用密切相关，详见表2。

图2 KEGG 富集分析气泡图Fig 2 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

表2 成分-疾病靶点的KEGG 信号通路(前20 条)Tab 2 KEGG signaling pathways of component-disease targets (top 20 items)

2.1.5 成分-靶点-通路的网络构建 上述的20条通路，包含108 个靶点，涉及19 个成分，将其导入Cytoscape 3.5.1 软件，构建“成分-靶点-通路”的网络关系图。红色圆形为中药苍耳子，紫色正方形为苍耳子的主要活性成分，黄色菱形为关键靶点，绿色六边形为关键通路，图形面积大小和颜色深浅与Degree 值成正比，如图3所示。根据Degree 值，排名前5 位的靶点为CASP3、TP53、TNF、MYC、PIK3CG。以上信息提示这些靶点可能是苍耳子发挥抗炎作用的重要靶点。

图3 成分-靶点-通路网络图Fig 3 Component-target-pathway network diagram

2.2 动物实验验证

2.2.1 鼻黏膜组织病理变化 各组大鼠鼻黏膜组织经HE 染色后在光学显微镜下观察，结果正常组大鼠鼻黏膜上皮组织结构完整，血管正常，组织未发生水肿，无浸润的嗜酸性粒细胞（见图4A）；模型组大鼠鼻黏膜上皮组织发生脱落，血管扩张充血，组织出现水肿，可见大量的嗜酸性粒细胞浸润（见图4B）；氯雷他定组及总水提液组大鼠鼻黏膜上皮组织基本完整，未见明显扩张的小血管，有少量浸润的嗜酸性粒细胞（见图4C及4D）；石油醚组大鼠鼻黏膜上皮组织脱落不明显，小血管充血扩张，伴有大量嗜酸性粒细胞浸润（见图4E）；乙酸乙酯组大鼠鼻黏膜上皮组织脱落，血管扩张，组织水肿，可见大量浸润的嗜酸性粒细胞（见图4F）；正丁醇部位组大鼠鼻黏膜上皮组织结构较为完整，血管无明显扩张的现象，有嗜酸性粒细胞浸润（见图4G）。

图4 各组大鼠鼻黏膜组织形态学变化比较（HE 染色，×200）Fig 4 Morphological changes in the nasal mucosa of the rats in each group（HE staining，×200）

2.2.2 对大鼠血清中IgE、IL-4 及IFN-γ水平的影响

各组大鼠血清中IgE、IL-4 及IFN-γ水平见表3。模型组大鼠血清中IgE 和IL-4 水平均明显高于正常组，IFN-γ水平明显低于正常组。与模型组相比，氯雷他定组、正丁醇组和总水提液组大鼠血清中IgE水平均明显低于模型组；石油醚组和乙酸乙酯组无显著性差异；各给药组大鼠血清IL-4 水平较模型组含量均显著降低，IFN-γ水平明显升高。

表3 各组大鼠血清中IL-4、IFN-γ 及IgE 的水平(n ＝8)Tab 3 Level of IL-4，IFN-γ and IgE in the rat serum in each group(n ＝8)

2.2.3 鼻黏膜组织PI3K、P-AKT、AKT 蛋白表达水平 与正常组相比，模型组PI3K 表达明显增加；与模型组相比，石油醚组，乙酸乙酯组与总水提液组PI3K 表达无显著性差异；正丁醇组PI3K 表达显著降低。与正常组相比，模型组P-AKT 表达显著增加；与模型组相比，石油醚组、总水提液组和正丁醇组P-AKT 蛋白表达明显降低，乙酸乙酯组P-AKT 蛋白表达无显著性差异；与正丁醇组相比，总水提液组和氯雷他定组P-AKT 蛋白表达无显著性差异，石油醚组和乙酸乙酯组P-AKT 蛋白表达显著性增加。各组大鼠AKT 总蛋白表达无明显差异。实验结果见图5。

图5 各组大鼠鼻黏膜组织PI3K、P-AKT、AKT 蛋白相对表达量Fig 5 Relative expression levels of PI3K，P-Akt and AKT in the nasal mucosal of the rats in teach group

3 讨论与结论

AR 作为一种常见的免疫异常类疾病，全球患有AR 者已超过5 亿，目前已成为主要的呼吸道慢性炎性疾病，给患者的生活质量和社会经济带来了负面影响[10]。中医认为AR 属于“鼻鼽”的范畴，认为正气不足、外邪侵袭是导致鼻鼽发生的主要原因[11]。机体免疫系统具有免疫监视、防御、调控机体的作用，这与“中医正气”抵御外邪入侵、驱邪外出、修复调节能力及维持脏腑经络的功能相似。因而治疗AR 需“扶正祛邪”，增强机体免疫调节能力。苍耳子作为一味传统中药材，已在临床上使用上千年，常被广泛用作发散风寒药，其最主要功效为“通鼻窍”作用，被称为“鼻科要药”。苍耳子临床常用于治疗鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊等病症，具有很好的疗效，但是对其药效作用机制仍需要不断研究。

苍耳子临床使用多为水煎煮法，本研究旨在研究苍耳子水提取部位中的有效成分对AR 的影响。苍耳子经过水煎煮法后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸、香草酸、绿原酸和丁二酸等水溶性成分，可出现在各个萃取部位中[8]。本研究通过网络药理学得到PIK3CA、AKT1、MAPK1 等108 个苍耳子核心治疗AR 的靶点，GO 分析结果主要涉及磷酸转移酶活性、信号转导、细胞增殖等。KEGG分析结果得到292 条通路，主要有涉及癌症通路、PI3K-Akt 信号通路、乙型肝炎、MAPK 信号通路、T 细胞受体信号通路等。其中PI3K-Akt 信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，广泛存在于细胞中，调控细胞增殖、凋亡及分化等功能。有研究表明PI3K-Akt 信号通路参与了炎性痛的形成与发展，在炎症部位损失组织及脊髓小胶质细胞中高表达，阻断或抑制PI3K/Akt/NF-κB 信号通路可缓解和减轻炎性痛的发生发展[12]。

本研究通过给予大鼠苍耳子不同提取部位，探究其作用机制，对网络药理学结果进行验证。AR 发病机制非常复杂，随着研究的不断深入，发现Th1/Th2 平衡与AR 的发病过程有着密切的联系，IL-4 和IFN-γ等Th 细胞因子参与了AR 的发病过程，并且对AR 的发生发展具有重要的影响。IL-4 和IFN-γ间存在着拮抗关系，能够互相调节，Th1 细胞释放的IFN-γ可以抑制Th2 的活化，进而抑制IgE 的产生。当γ-干扰素的释放量缺少时，Th2 细胞因子功能亢进，分泌的IL-4 增多，诱导B 淋巴细胞释放IgE，导致AR 发生[13]。通过观察鼻黏膜病理学变化可以科学地反映AR 的变化情况，并且可以直接根据AR 大鼠鼻黏膜组织病理变化及血清中IL-4、IFN-γ及IgE 浓度判断造模是否成功。本研究综合分析各种检测指标的结果，苍耳子水提液经萃取得到的正丁醇部位可以减轻AR 大鼠打喷嚏、流鼻涕等过敏性症状，改善鼻黏膜组织形态学的变化，降低血清中IL-4 和IgE 的水平，升高IFN-γ的水平，可能是苍耳子发挥治疗AR 的作用的活性部位。KEGG 结果表明PI3K/AKT 通路为苍耳子治疗AR 的关键通路。袁家胜[14]研究发现通过敲除小鼠的CCR3基因可以降低PI3K/AKT 信号通路的激活水平，缓解小鼠AR症状。Chen 等[15]发现屋尘螨（HDM）提取物刺激的鼻上皮细胞（NEC）和体外刺激得到的AR 模型小鼠鼻黏膜组织中均发现PI3K/AKT 通路表达被激活。PI3K/AKT 通路和中性粒细胞关系密切，其下游因子对中性粒细胞的趋化和存活有重要影响。PI3K/AKT 通路可以通过活化HIF-1α，来调节巨噬细胞和树突状细胞的活性；调节中性粒细胞的功能；调节T细胞的发育、分化和功能。本实验结果表明，AR 模型大鼠鼻黏膜组织中PI3K 和P-AKT 蛋白表达增加，AKT 总蛋白含量无明显变化。给予药物治疗干预后，各给药组PI3K、P-AKT蛋白表达下调且正丁醇组的蛋白表达量下调最为显著。由此推断，苍耳子正丁醇部位可抑制PI3K蛋白表达，而使得AKT 蛋白磷酸化被抑制，减轻鼻部炎性症状。

综上，本研究通过网络药理学预测了治疗AR 的靶点与通路，通过鼻黏膜组织HE 染色，血清炎症因子IL-4、IFN-γ及IgE 及鼻黏膜组织中PI3K、AKT、P-AKT 蛋白的检测来验证网络药理学预测结果，初步揭示了苍耳子正丁醇部位治疗AR 的作用机制，为后期继续探索其治疗AR 机制提供理论依据。