生物炭对设施连作土壤真菌群落结构与多样性的影响

王雪玉 刘金泉 胡 云 田 勇 田 凤 李 明

(内蒙古农业大学职业技术学院， 包头 014109)

0 引言

随着设施蔬菜产业的不断发展，设施蔬菜种植土壤也随之不断退化。尤其是一些长时间连作的设施蔬菜种植地，土壤退化现象日趋严重，从而影响了设施蔬菜产业的可持续发展。近年来，各类以作物秸秆为主要原材料的营养基质逐步代替土壤进行蔬菜栽培，同时，将作物秸秆燃烧炭化后形成的生物炭作为一种新型解决连作障碍栽培方式，受到了国内外许多研究者的关注[1-5]。

生物炭是秸秆原料在低氧高温下裂解炭化制备的新型环境友好型土壤改良剂，并且在农业土壤改良中起到了积极作用[6-8]。研究表明，生物炭还可以通过改变土壤微生物群落的结构组成以及微生物物种的丰富度来改变土壤养分的循环及结构[9-10]。随着现代农业机械化产业的发展，许多农业生产活动，如过量无机肥的施入、大量地膜残留以及过量农药残留等，导致土壤中微生物群落结构的严重破坏，并且在一定程度上减少了土壤中微生物的数量及微生物的多样性[11]。生物炭因其自身特殊结构及性质使其具有巨大的比表面积和较高的孔隙度，从而成为土壤中众多微生物栖息场所，不仅如此，生物炭由于含有特殊的有机物质，在微生物生长代谢中提供部分营养物质。因此，添加生物炭可以有效地改善土壤微生物的性质及群落结构[12]。

真菌作为一种微生物广泛存在于土壤中，占地下总微生物量的81%～95%，在植物与土壤之间、土壤与大气之间碳循环中发挥着重要作用，在土壤中有分解部分有害生物及有毒物质的作用，且能在生物炭的孔隙中更好地生长、繁殖[13]，因此，生物炭的添加可以增加真菌丰度，提高土壤真菌与细菌丰度比[14-15]。BAMMINGER 等[16]通过对温带农田土壤中施加2%的生物炭，发现生物炭可同时提高土壤中真菌和细菌的比例。MUHAMMAD等[17]将不同材料制成的生物炭添加到砂质壤土中，结果表明土壤真菌丰度显著增加，同时发现真菌丰度及真菌与细菌丰度比随着生物炭用量的增加而呈增加趋势。

目前，关于生物炭对土壤改良、肥力提升及土壤微生物群落结构方面的影响已有很多报道[18-20]。关于生物炭对微生物影响的研究主要集中在微生物量、微生物群落结构、微生物功能、土壤酶活性[21-23]等方面。近年来土壤健康问题越来越受到重视，设施蔬菜土壤的健康状况成为关注和需要解决的瓶颈问题。不健康土壤会导致土传病害的连年发生，对植物的生长发育造成一定的危害，并且导致产量和品质下降[24]，微生物在土壤营养物质循环中起着主要作用，同时提供重要的生态系统服务功能[25]。基于此，本文针对设施连年种植蔬菜土壤质量退化现状，通过对不同种植年份的土壤分别添加同量的玉米秸秆生物炭，研究土壤真菌群落变化规律及真菌多样性，为生物炭改善设施土壤质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年4—7月和9—12月在内蒙古农业大学职业技术学院园艺园林实践教学基地日光温室进行。试验日光温室为水蓄热内保温装配式结构，南北跨度为9 m，东西长度为50 m。生物炭由河南立泽环保科技有限公司提供，类型为玉米秸秆炭，有机碳质量比404.02 g/kg，全氮质量比8.36 g/kg，全磷质量比2.33 g/kg，全钾质量比15.43 g/kg，pH值7.85。

1.2 试验方法

通过盆栽试验方法，分别取连续种植0、1、5、10、15、20年蔬菜土壤，每公顷均匀施入20 t生物炭，共6个处理，分别用CK、L1J、L5J、L10J、L15J、L20J表示。于2021年4月10日及9月20日定植嫁接黄瓜“德尔3号”幼苗，每个处理10盆，重复3次，于结果末期取根系周围土壤，测定各项指标。

1.3 项目测定

1.3.1高可变区引物设计和PCR扩增

ITS测序使用的文库构建步骤遵循Illumina测序仪文库构建方法。本次测序以TS2为目标区域进行引物设计，利用DNA模板50 ng、25 μL的PCR体系，使用Pbusion酶扩增2～35个循环，引物序列为：fITS7 GTGARTCATCGAATCTTTG和ITS4 TCCTCCG CTTATTGATATGC。

1.3.2Illumina测序文库构建(加入接头)

由于一次上机的样本数较多，一轮PCR扩增反应之后，需要在正反引物两端分别加上不同的Barcode以区分不同的样本。扩增完成后的PCR产物使用Reads纯化之后进行上机测序。

1.3.3归一化处理

PCR产物用AxyPrep Mag PCR Normalizer 进行归一化处理。

1.3.4上机测序

构建好的文库上样到cBot或簇生成系统，用于簇生成及MiSeq测序。

试验测序分析针对Illumina MiSeq 2×300 bp paired-end测序数据进行分析。对于MiSeq 测序获得的双端数据，首先根据Barcode信息进行样品区分，然后根据Overlap关系进行Merge拼接成Tag，接着对拼接完成的数据进行数据过滤，随后进行Q20、Q30等质控分析。对最终获得Clean数据进行OTU聚类分析和物种分类学分析。

1.4 数据优化、分析与统计

先对原始数据进行如下处理：①去除Reads的Barcode和接头序列。②将每一对Paired-end Reads拼接合并成一条更长的Tag。③去除含有N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于5%的Tags。④去除低质量Tags(质量值Q<10的碱基数占整个Tag的20%以上)。从而得到Clean数据以进行后续分析。

试验部分原始数据采用Excel 2003软件整理，采用RDP(Ribosomal database project)11.3数据库对真菌进行分类及群落结构分析，分类的置信度阈值为0.8。

2 结果与分析

2.1 生物炭对土壤真菌群落结构的影响

由图1可以看出，同一个物种在不同样品中的变化，同时可以看出各个物种的表达量及样品序列的百分比。从门分类水平上各处理的物种表达量来看，对已知的真菌种类来说，子囊菌门(Ascomycota)的表达量最高，占总数的58.8%，其次是担子菌门(Basidiomycota)，占总数的10.0%，表达量最少的是球囊菌门(Glomeromycota)，占总数的0.3%。从门分类水平上各物种在各处理中的样品序列百分比来看，在已知的真菌种类中，子囊菌门(Ascomycota)在L10J及CK所占比例最多，分别为78.9%及76.0%，L15J中比例最小，为21.7%，最高处理与最低处理间存在较大差异；担子菌门(Basidiomycota)在L15J处理所占比例最多，为39.9%，在L10J处理含量最少，为0.7%，最高处理与最低处理间存在较大差异；壶菌门(Chytridiomycota)在L1J处理比例最多，为3.7%，在L20J处理比例最少，为0.1%，最高处理与最低处理间存在较大差异；球囊菌门(Glomeromycota)在各个处理的比例均非常少，其中在L1J处理比例为0.7%，相比其他处理来说含量最高，在L15J、L20J及CK处理均未发现球囊菌门；接合菌门(Zygomycota)在L15J处理比例最多，为14.7%，在L10J比例最少，为1.9%，最高处理与最低处理间存在较大的差异。

图1 不同处理物种区域图Fig.1 Regional map of different treated species

为了更直观地反映物种的丰富度及相似性，将门分类水平上的物种信息使用Heatmap(热图)表现(图2)。在门分类水平上，施加生物炭后显著增加了子囊菌门(Ascomycota)在各处理中的丰富度，而且在L10J处理的丰富度最高，其次是CK、L1J、L20J，在L15J处理丰富度最低；在一定程度上提高了担子菌门(Basidiomycota)在L15J处理的丰富度。经聚类分析进一步表明，担子菌门(Basidiomycota)在各处理中相对来说属于物种较高的一类，其次是接合菌门(Zygomycota)，且两个菌群聚为一类；从各处理的聚类分析来看，L5J、L20J、L1J、CK及L10J的物种数都比较丰富，且在这几个处理中拥有相同的物种，但每个处理的物种丰富度各不相同。

图2 不同处理门分类水平上的分类热图Fig.2 Classification heatmap at different processing gate classification levels

2.2 生物炭对土壤真菌多样性的影响

相对丰度(Rank abundance)曲线用来说明多样性的两方面：物种的丰度和均匀度。从曲线水平方向来看，曲线宽度反映物种丰度，曲线在横轴上宽度越大，则代表物种丰度越高；曲线形状(平滑程度)反映样品中物种均匀度，曲线越平缓，物种分布就越均匀。从图3可以看出，各处理在OTU相对丰度为10-4时的物种丰度都比较高，最高的为L1J，L20J、L10J、CK次之，且在OTU相对丰度为10-4时的物种分布相对均匀；随着OTU所含序列数的增加，物种的丰度逐渐下降，物种均匀度也随之降低。总体来说，L1J处理的物种丰度最高、物种分布最均匀，显著高于对照。

图3 不同处理等级丰度曲线Fig.3 Abundance map of different treatment grades

Alpha多样性通常用于度量群落生态中物种的丰度，测定土壤真菌Alpha多样性，结果如表1所示。由可视指数可知，各处理的物种数均很丰富，其中以L10J处理显著增加土壤真菌可视指数多样性,其他各处理与对照相比，在一定程度上降低了土壤真菌的可视指数多样性；从超指数来看，L10J的指数值最大，为692.00，说明L10J的物种总数最多，其次为CK，为613.13，物种总数最少的处理为L20J，为372.19；辛普森指数代表物种的多样性，从辛普森指数来看，物种多样性最高的处理是CK，为0.93，最低的处理是L1J，为0.51，各处理与对照相比，都在不同程度上降低了真菌的丰度；香浓指数同样也代表各处理中物种的多样性，从香浓指数来看，多样性最高的为L10J，为6.81，与对照相比，显著增加了真菌物种多样性，多样性最低的处理为L5J，为4.19，其他处理在不同程度上降低了真菌的物种多样性。

表1 根际土壤真菌Alpha指数Tab.1 Alpha index of rhizosphere soil fungi

2.3 土壤真菌OTU聚类分析

通过OTU分析，可以知道处理中微生物多样性和不同微生物的丰度利用。venn图可用于统计多个处理中所共有和独有的OTU数目，可以比较直观地表现土壤环境中各处理中的OTU数目组成相似性及特异性。由图4可知，L15J与L20J之间共有微生物数目为22个，其中L15J独有的微生物数目为184个，L20J独有的微生物数目为206个；L15J与L5J之间所共有的微生物数目为33个；L20J与L5J之间所共有的微生物数目为41个；L15J、L5J、L20J 3个处理之间共有微生物数目为72个，L5J独有的微生物数目为152个。CK与L10J之间共有的微生物数目为10个，与L15J之间共有的微生物数目为25个，与L1J之间共有的微生物数目为23个；L10J与L5J之间共有的微生物数目为14个，与L1J之间共有的微生物数目为15个；L5J与L1J之间共有的微生物数目为15个；CK、L10J及L5J之间所共有的微生物数目为18个，L10J、L5J及L1J之间所共有的微生物数目为7个，CK、L1、L5J之间所共有的微生物数目为16个，CK、L10J、L1J之间所共有的微生物数目为12个；4个处理之间共有的微生物数目为70个；CK独有的微生物数目为198个，L5J独有的微生物数目为133个，L10J独有的微生物数目为130个，L1J独有的微生物数目为165个。从上述结果可以看出，L20J特有微生物数目比CK增加了8个，说明在生物炭的添加下可以增加L20J土壤中微生物的数量；L15J、L5J、L20J 3个处理之间共有微生物数目最多，为72个，说明生物炭添加下能够缩小L15J、L5J、L20J 3个处理之间微生物的多样性差异。

图4 不同处理OTU分布venn图Fig.4 The venn diagram of OTU distribution for different treatments

物种累积曲线可预测抽样量是否充分，并可以预测所有处理中物种的丰度，横坐标代表抽取的样品数量，纵坐标代表抽样后OTU数目，结果展示持续抽样下OTU(新物种)出现的速率，在一定范围内，若曲线表现为急剧上升则表示环境中随着样品量的加大有大量新物种被发现，当曲线趋于平缓，则表示此环境中的物种并不会随样品量的增加而显著增多。从真菌的物种累计曲线来看(图5)，在200～400个OTUs时有大量真菌的新物种出现，随着样品数量的增加，新物种的数量也随之增加，但是增加不显著，在1 000个OTUs时新物种的出现速率呈下降趋势。

图5 生物炭处理下物种累计曲线Fig.5 Species accumulation curve under biochar treatment

2.4 科分类水平土壤真菌丰度分析

表2为各处理在科分类水平上各真菌的丰度。从表中可见，在科分类水平上，从各科群落占总物种比例来看，未识别科、Incertae sedis 27、小子囊菌科(Microascaceae)、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)、爪甲团囊菌科(Onygenaceae)以及担子菌门粪锈伞科(Bolbitiaceae)在总物种比例中相对较高，分别占物种总数的比例为9.4%、5.0%、5.0%、3.5%、3.7%、2.2%，构成了土壤中的优势菌群；从各处理在这些优势菌群中的比例来看，L10J、L15J 处理均可显著提高上述菌群不同科分类水平的丰度。

表2 真菌在科分类水平的丰度比较Tab.2 Comparison of fungal species abundance at level of classification in class

3 讨论

秸秆生物炭不仅是富含碳的有机物质，还包括氮、氧、硫等多种养分元素和无机碳酸盐成分，其施入土壤中可以增加土壤有机碳含量，并能提供微生物可利用组分[26]， 微生物在土壤生态系统的物质循环和能量流动过程中发挥着重要的作用，它可以直接或间接参与生物炭在土壤中的降解、迁移和转化过程[27]；生物炭作为一种性质独特的物质，其孔隙结构及对水肥的吸附作用可直接为土壤微生物提供良好的栖息环境和生长所需养分[28-29]。与细菌相比，真菌在土壤中以多种方式吸收营养，土壤环境发生变化，部分真菌会迅速改变自身的营养方式，以对抗因环境变化带来的不利影响，这是一种较高的生存策略[30]。本试验中，经生物炭处理的土壤均在一定程度提高了部分有益真菌的菌群数量，担子菌门在土壤中通常会与植物根系共生形成菌根，有利于植物生长，所以属于优势菌群，本试验中担子菌门的表达量占10.0%，在门分类水平上与对照相比，增加了有益菌群担子菌门(Basidiomycota)及接合菌门(Zygomycota)在L15J处理中的比例，降低了不利菌群壶菌门在L15J处理中的比例，而壶亚门属于高等植物上的寄生物，会引起玉米褐斑病及马铃薯癌肿病等，所以属于不利菌群；通过不同处理在门分类水平上分类热图进一步可以看出，生物炭处理下均在不同程度上提高了各处理优势菌群担子菌门的比例。综合来看，以种植15年蔬菜土壤(L15J)添加生物炭效果最为显著，这为设施蔬菜土壤改良提供理论依据。

施加生物炭可以改变土壤环境，进而促进微生物群落组成和结构的改变[31]。通过对不同处理物种等级丰度分析及Alpha多样性分析表明，施加生物炭后提高了连作蔬菜土壤中真菌的多样性，其中以L1J处理的物种等级最高，而且在OTU丰度为10-4时物种分布最均匀；从Alpha指数来看，各处理以L20J中的物种数量最多、丰度最高，表明在一定的生物炭处理下，能够增加种植20年蔬菜土壤中的真菌多样性及真菌丰度，这与前人的研究结果一致[32]。土壤真菌OTU聚类分析表明：在对所有处理样本进行聚类后，所有样本平均OTU数目为166.85，以L20J独有的真菌数目最多，为206个，说明连作20年土壤中真菌数量具有特异性；其次是 L15J，为184个，独有真菌数目最少的处理为L10J，为130个，各处理之间共同拥有的真菌数量为70个及72个，说明各处理之间拥有真菌多样性的差异比较小，同时可以看出，随着种植年限的增加，土壤中的菌群特异性随之增加，并且在200～400个OTUs时有大量真菌的新物种出现，在1 000个OTUs时新物种的出现速率呈下降趋势，这一试验结果既在前人的研究基础上得到了进一步的补充和创新，又为后期的研究奠定了基础。

4 结束语

通过盆栽试验，利用高通量测序技术分析了不同种植蔬菜年限土壤经一定量的生物炭处理后的真菌群落结构，结果表明：通过对不同种植蔬菜年限的土壤施入一定量的生物炭处理后，改变了土壤真菌群落结构，影响了土壤真菌菌群的物种数量，并且在一定程度上提高了部分有益菌群担子菌门(Basidiomycota)及接合菌门(Zygomycota)的丰度及多样性，综合来看,以 L15J及L20J处理中优势菌群丰度及物种多样性最高，同时降低了部分有害菌群壶菌门(Chytridiomycota)的丰度及多样性。