流动注射-化学发光法在药物分析中的应用进展

翟 倩,杨文霞,李 佳,高亚娟

(空军军医大学第一附属医院 妇产科,西安 710032)

流动注射是在热力学非平衡状态下即可完成样品在线处理与测定的动态定量分析技术[1]。该技术在1975年由丹麦学者RUZIKA 和HANSEN 首次提出,目前已被广泛应用于分析化学的各个领域,促进了分析自动化的发展[2]。流动注射作为一种简单、快速、自动化的进样和分离技术,常与其他测定方法联用,例如原子吸收光谱法[3-4]、高效液相色谱法[5]、化学发光法[6]以及毛细管电泳法[7]等。化学发光法是一种高灵敏度的检测方法,在化学成分分析中应用广泛[8]。流动注射-化学发光法集二者的优点于一身,具有灵敏度高、分析快速、分析成本低、线性范围宽、操作简单且无需任何激发光源等优势,已被广泛应用于药物分析、环境监测、食品分析、生命科学等领域中[9-12]。目前,该方法在医药领域的应用尚无系统性的文献总结。鉴于此,本工作综述了流动注射-化学发光法的原理、特点及主要的化学发光体系,以及该方法在近二十年国内外药物分析领域的应用进展,并对该方法的应用前景和发展趋势做出展望。

1 简要介绍

1.1 流动注射技术

在进行流动注射测试时,需要把一定量的样品注入无气泡间隔的流动试剂中,在非平衡状态下完成样品的在线处理与分析。与传统的化学分析法相比,它不需要反应物之间达到化学平衡,故可获得均匀平衡体系无法提供的信息,能很好地应用于不稳定反应的定量分析中,是分析技术的一次革新[13]。该技术大大提高了分析方法的分析速率、选择性和灵敏度,具有仪器装置体积小、操作简单、分析快速、灵敏度高、结果重复性好和检出限低等优点,广泛适用于动力学反应、化学发光反应、生物发光反应以及低稳定的反应体系[14-15],而与其他技术的连用[16-17],大大拓展了该技术的应用领域。

1.2 化学发光法

化学发光法是一种由化学反应引起的光辐射现象,其发光原理是反应体系中的某些物质分子如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量,由基态跃迁至激发态,然后再从激发态返回基态,将能量以光辐射的形式释放出来,从而产生化学发光[18]。化学发光法是基于反应体系中待测物含量和体系化学发光强度在一定条件下呈线性关系来进行定量分析的,是一种具有超高灵敏度的痕量分析方法,近年来被广泛应用于痕量金属离子、无机化合物、有机化合物及生物分析等领域[19-21]。化学发光法中的发光体系大致有4 类[22]:无机离子-化学发光体系、无机离子催化-氧化剂-化学发光体系、无机离子催化有机物的氧化-化学发光体系、乳化剂-化学发光体系。近年来常用于流动注射-化学发光法的发光体系如下所示。

1.2.1 鲁米诺化学发光体系

鲁米诺(Luminol)试剂是应用最早、最广泛的化学发光试剂之一,具有结构简单、性质稳定、易于合成、水溶性较好且安全无毒等优点。在碱性条件下,Luminol试剂可被很多氧化剂(过氧化氢、高碘酸、铁氰化钾、高锰酸钾等)氧化而处于激发态,激发态再回到基态,会发出425 nm 的蓝光。由于Luminol试剂化学发光体系的反应速率较慢、发光强度较弱,常常需要在反应体系中添加无机催化剂(Mn2+、Cr3+、Fe3+、Fe2+、Co2+、Cu2+等)或酶类化合物(辣根过氧化酶、过氧化氢酶、微过氧化酶、黄嘌呤氧化酶等)[23],也可以直接用一些待测药物作催化剂或增敏剂,或间接通过化学反应产生这些催化剂或增敏剂,使发光强度增强或抑制,从而实现对药物的检测。

1.2.2 吖啶酯类化合物化学发光体系

光泽精(N,N-二甲基二吖啶硝酸盐)是最早被发现且应用最广泛的一种吖啶酯类发光试剂。在碱性介质中,光泽精被氧化为四元环过氧化物中间体,而后裂解生成激发态的吖啶酮,回到基态时会发出440 nm 的蓝绿光,过氧化氢等氧化剂可大大增强其发光强度。与Luminol试剂相比,光泽精发光效率更高[24],很多吖啶酯类化合物也具有同样的化学发光特征,已被广泛应用于生命科学研究领域。

1.2.3 过氧化草酸酯化学发光体系

过氧化草酸酯化学发光体系的主要组分包括芳香草酸酯、过氧化氢和荧光剂,是迄今为止发现的最高效的非生物化学发光体系。在合适的荧光剂存在下,过氧化氢会氧化芳香草酸酯,产生具有高能量、不稳定的中间产物过氧草酸酯,荧光剂接收能量呈激发态,再回到基态时释放光子产生光辐射[25]。此反应体系的发光强度与荧光剂特性有关,而与化学发光试剂种类和性质无关。但是,由于该发光体系反应物的水溶性较差且不稳定,其在化学分析中的应用有限。

1.2.4 Ce(Ⅳ)化学发光体系

在酸性介质中,Ce(Ⅳ)具有很强的氧化性,可以与很多还原性无机化合物或有机化合物发生氧化还原反应,Ce(Ⅳ)被还原生成激发态的Ce(Ⅲ)*,产生化学发光,目前已应用于很多药物的化学发光分析中[26]。

1.2.5 高锰酸钾化学发光体系

高锰酸钾具有强氧化性,在酸性介质中,大部分有机化合物和无机化合物都可以与其发生氧化还原反应并产生化学发光。高锰酸钾化学发光体系具有发光强度稳定、成本低和适应性强等优点,在化学分析领域中应用广泛[27]。

1.2.6 钌联吡啶化学发光体系

Ru(bipy)32+具有独特的化学稳定性、氧化还原性和发光性,在酸性介质中,能与氧化剂反应产生Ru(bipy)33+,可被某些待测有机化合物还原为激发态的[Ru(bipy)32+]*,其返回基态时会产生化学发光,发光强度与有机化合物含量在一定范围内呈线性关系,以此完成对有机化合物的定量分析[28]。

1.2.7 亚硫酸盐化学发光体系

亚硫酸盐可以被某些强氧化剂氧化产生化学发光,而一些有机化合物可以增强该体系的发光强度。亚硫酸盐含量在一定范围内与发光强度成正比,以此完成对这些有机化合物的定量分析[29]。

1.3 流动注射-化学发光法

该方法最初主要应用于一些离子的定量分析,随着方法的不断改进,逐渐用于复杂待测物的分析[30]。流动注射-化学发光分析测试系统主要由载流驱动系统、反应器、检测器和信号检测装置组成[31],见图1。

由图1可知,反应溶液经蠕动泵泵入,经六通阀混合后进入检测池发生化学发光反应,产生的光学信号经光电倍增管放大,计算机读出检测信号,以待测物含量和峰高绘制校正曲线,并计算分析结果。

图1 流动注射-化学发光法流路图Fig.1 Flow diagram of flow injection-chemiluminescence

2 在药物分析中的应用

药物分析在药物研发、生产以及临床应用中有重要作用[32],常用的分析方法有滴定法、紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、原子吸收光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱扫描法、电化学法、红外光谱法和质谱法等[33-37]。滴定法灵敏度低、操作繁琐且分析耗时长;荧光分光光度法和高效液相色谱法需要激发光源和分光系统,设备复杂、背景信号高、仪器价格昂贵;电化学法不稳定且重现性差;光谱法和质谱法设备昂贵,难以广泛推广。流动注射-化学发光法作为一种具有高灵敏度和较宽线性范围的痕量分析方法,可以很好地应用于药物的药效、动力学和机理等方面的研究。本工作对近二十年报道的流动注射-化学发光法在维生素类、抗生素类、激素类、抗肿瘤类、中药及其他类药物分析中的应用做了概述。

2.1 维生素类药物

维生素是维持细胞正常生理功能的天然有机物质,其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的维生素有20余种[38],可用于维生素缺乏症的预防和治疗,也可作为其他疾病治疗的辅助药物。但是,长期或过量服用维生素会对人体健康产生严重危害,因此维生素类药物的分析对临床用药有很高的价值[39]。流动注射-化学发光法在维生素类药物分析中的应用如表1所示。

表1 流动注射-化学发光法在维生素类药物分析中的应用Tab.1 Application of flow injection-chemiluminescence in vitamin drug analysis

2.2 抗生素类药物

抗生素类药物是指可消除或者抑制病原微生物的一类药物,主要包括β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类和大环内酯类等[48]。抗生素类药物是治疗动物和人类疾病的一种常用药物,流动注射-化学发光法在该类药物分析中的应用如表2所示。

表2 流动注射-化学发光法在抗生素类药物分析中的应用Tab.2 Application of flow injectio-chemiluminescence in antibiotics drug analysis

表2 (续)

2.3 激素类药物

激素类药物是以人体或动物激素(包括与激素结构、作用原理相同的有机化合物)为有效成分的药物,可分为糖皮质激素、肾上腺皮质激素、去甲肾上腺激素、孕激素、雌激素、雄激素等[98]。激素类药物应用广泛,可用来预防、治疗、诊断疾病或帮助机体恢复正常机能等。激素类药物治疗效果显著,但由于其药理作用复杂,若应用不当将带来各种不良反应。目前报道的流动注射-化学发光法在激素类药物分析中的应用如表3所示。

表3 流动注射-化学发光法在激素类药物分析中的应用Tab.3 Application of flow injection-chemiluminescence in hormone drug analysis

2.4 抗肿瘤类药物

抗肿瘤类药物包括化疗药物、生物制剂等[114]。流动注射-化学发光法在抗肿瘤类药物分析中的应用如表4所示。

表4 流动注射-化学发光法在抗肿瘤类药物分析中的应用Tab.4 Application of flow injection-chemiluminescence in antitumor drug analysis

2.5 中药

中药是以中国传统医药理论为指导,采集、炮制成的一类药物,它主要来源于天然药及其加工品,包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物,因此中药具有成分含量不均衡或成分复杂等特征。流动注射-化学发光法可以准确定量分析中药中的活性成分,该方法在中药中的应用如表5所示。

表5 流动注射-化学发光法在中药分析中的应用Tab.5 Application of flow injection-chemiluminescence in traditional Chinese medicine analysis

2.6 其他类药物

流动注射-化学发光法还可以用于其他多种药物的分析,例如生物碱类药物,多巴胺、类中枢神经药物,解毒镇痛抗炎性药物,免疫抑制药等见表6。

表6 流动注射-化学发光法在其他类药物分析中的应用Tab.6 Application of flow injection-chemiluminescence in other drug analysis

3 问题和展望

流动注射-化学发光法分析快速、精密度和灵敏度高,在药物分析中应用广泛,但是仍存在一些亟待解决的问题:①发光体系的灵敏度还达不到某些痕量分析的期望,方法检出限和实际要求仍有一定差距,需要寻找更好的发光试剂、发光体系或者增敏剂;②成分复杂的药物中的干扰物质较多,方法的抗干扰能力和选择性有待提高;③需设计更加便携和自动化更高的流动注射-化学发光分析仪,使其易于推广和实现复杂体系的有效检测;④流动注射-化学发光法在推广应用前,需要进行大量的试验和考查论证。

随着发光体系的不断优化、高效发光体系与发光试剂的开发和化学发光技术及其灵敏度的逐渐提高,流动注射-化学发光法在药物化学、免疫分析、矿物分析、临床医药、环境检测和生命科学等领域中有着巨大的潜力和广阔的应用前景。