巴豆生物碱对Lewis小鼠肺腺癌细胞生长和凋亡的影响及机制研究*

武晓，谷勤勤，于淼淼，刘凤娟，孙荣丽

（青岛大学附属青岛市中心医院1.呼吸与危重症医学科，2.病理科，3.放射科，山东青岛 266042）

肺癌已经成为威胁人类健康的重大疾病之一，主要采取多学科综合治疗模式，而中西医结合治疗肺癌是我国的特色[1]。中药抗肺癌的研究越来越多[2]，其中巴豆就是一种用于抗癌的中草药[3-4]，查阅国内外文献，巴豆生物碱（CA）是巴豆提取物的一种，CA 对于胃癌、卵巢癌、肠癌等癌症均有抗癌作用[5-6]，但有关CA 抗肺癌作用的报道较少，前期的初步研究发现CA 具有较好的体内暴露量，能够抑制肺癌的生长，但具体的作用机制尚不明确，目前国内外尚无关于CA 体内对肺癌细胞的作用机制及对肿瘤相关凋亡蛋白表达的影响的相关研究报道。那么CA 作用于体内是否可抗肺癌？是否通过诱导肿瘤细胞凋亡抗癌？具体机制是什么？为此本研究在前期体外试验研究的基础上行体内实验（Lewis 肺腺癌小鼠），进一步探讨CA 对肺腺癌生长和凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Lewis 小鼠肺腺癌细胞（Lewis mouse-derived lung adenocarcinoma cells, LLC）由上海中国科学院提供；SPF 级C57BL/6 小鼠，4～6 周龄，雄性，体重25～30 g，共50 只，由重庆恩斯维尔生物科技有限公司提供[实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004]；DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、水合氯醛、无水乙醇等购自北京中杉金桥生物技术有限公司；凋亡试剂盒及各引物购自上海生工生物工程股份有限公司；CA 购自山东中医药大学；顺铂购自德州德药制药有限公司；PrimeScript RT试剂盒购自日本TaKaRa 公司。

1.2 仪器与设备

离心机购自上海安亭科学仪器厂；二氧化碳培养箱购自日本三洋公司；倒置显微镜购自日本Nikon 有限公司；电子分析天平购自瑞士Precisa 公司；生物组织自动包埋机、生物组织烤片机、DM500 光学显微镜购自德国Leica 公司。

1.3 方法

1.3.1 药物配制及分组将20 mg 顺铂溶于5 mL生理盐水，即4 mg/mL，按照75 mg/m2给药。CA 原液浓度为200 μg/ml，分别按照低剂量0.6 mg/kg、中剂量1.2 mg/kg 和高剂量2.4 mg/kg 对小鼠注射。将小鼠随机分为对照组、低剂量CA 组、中剂量CA组、高剂量CA 组及顺铂组。对照组不注射任何药物；低剂量CA 组、中剂量CA 组、高剂量CA 组分别按0.6 mg/kg、1.2 mg/kg 和2.4 mg/kg 的剂量注射CA 注射液；顺铂组按75 mg/m2的剂量经腹腔注射顺铂溶液。

1.3.2 小鼠成瘤及瘤体测量①小鼠皮下接种。取对数生长期细胞，制成浓度为5×107个/mL 的细胞悬液，按照分组进行接种，每只小鼠于右腋皮下缓慢接种200 μL 细胞悬液，拔针后迅速用针头将细胞聚集，以防止细胞液外漏。②成瘤观察与测量。皮下接种成功后，每天观察小鼠的精神状况，形成肿瘤后，每2 天测量1 次肿瘤的长径和短径，并计算肿瘤的体积（肿瘤体积=0.52×短径×长径2）。③生存状态的观察。每天下午3 点记录小鼠的进食量（先设定每组固定进食量为50 g），期间再观察小鼠的精神、活动状态，以及小鼠的毛色和光泽度等一般状况。④差异化处理。接种细胞1 周后即第8 天开始按照之前的分组腹腔注射给药，⑤肿瘤抑瘤率测定：剥取肿瘤后称重，计算抑瘤率（抑瘤率=1-药物组平均瘤重/对照组平均瘤重×100%）。

1.3.3 肿瘤病理切片的制备及苏木精-伊红染色先用二甲苯溶解烘烤完毕组织切片上残留的石蜡，然后按以下顺序进行梯度水化：无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇，苏木精染色，1%盐酸乙醇分化，稀氨水返蓝，伊红染色，自来水洗去浮色后，可于光学显微镜下观察染色情况。之后，按照80%、90%、95%乙醇，无水乙醇2 次，二甲苯2 次的顺序进行脱水，最后用中性树胶进行封片。

1.3.4 qRT-PCR 法检测Survivin、Caspase-3、Bax、YAP mRNA 相对表达量提取细胞总RNA：细胞孔板中加300 μL Trizol，转入EP 管中，加入氯仿（0.2 mL），待转为粉色时，静置5 min，13 000 r/min离心15 min，吸取上清液至新EP 管，加入0.5 mL异丙醇，静置10 min，离心弃上清液，加入75%乙醇1 mL，离心干燥EP 管中沉淀，溶解沉淀，溶解总RNA（55～60℃水浴5 min），检测RNA 浓度和纯度。RNA 质量测定：用DEPC 空白调零，吸取2 μL溶解后的总RNA 加入上样孔，检测光密度（OD）值，当OD 值介于1.8～2.0 之间（260/280），RNA纯度好。使用PrimeScript RT 试剂盒（TaKaRa，Shiga，日本）将每个样品的1 mg 总RNA 逆转录为cDNA，根据上海生工基因库设计引物和探针。qRT-PCR 反应条件：50℃预变性2 min，95℃变性4 min，54℃再变性15 s，72℃退火5 s，83℃延伸15 s，最后，在72～95℃（0.5℃增量）下熔解，每个步骤熔解5 s。每个样本以GAPDH为内参基因，将每个样本的阈值周期（Ct）归一化，每个样本都是重复检测的。按照2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量，通过每组3 个样本的几何平均值得到各基因的最终相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blotting检测Survivin、Caspase-3、Bax、YAP 蛋白相对表达量Loading buffer 提取蛋白，RIPA 裂解液裂解30 min，将裂解液转入EP 管中离心，置入-80℃冰箱冷冻保存。蛋白浓度测定及预变性：将蛋白标准品加入标准品稀释液，加BCA 工作液，混匀，37℃孵育30 min；测定562 nm的OD 值，计算样品蛋白浓度。根据分子量大小选择浓度，配制分离胶混匀后灌胶，异丙醇液封压胶，静置30 min，弃掉异丙醇，滤纸吸干，加浓缩胶，插入梳子，静置1 h。每组样本各取10 μg 总蛋白与15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后应用80 V 恒压转膜120 min，封闭1 h，TBST 洗涤3 次；将PVDF 膜剪成条带放入孵育皿中（按目的蛋白和Marker 分子量大小），上述4 种抗体及内参GAPDH以1∶1 000 4℃摇床上孵育，次日TBST 洗涤3 次，加入羊抗兔二抗孵育1 h，弃二抗，TBST 洗涤3 次。压片，调整曝光时间，将X 射线片放入显影液中，出现条带后放入定影液中，取出X 射线片，风干，扫描图片保存，采用Image J 软件分析灰度值。以目的蛋白条带与GAPDH 条带灰度值比值为目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用SNK-q检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺癌LLC细胞生长状态

光学显微镜低倍镜下观察细胞形态，小鼠LLC细胞呈上皮样贴壁生长，有些细胞呈圆形、梭形，生长状态良好。见图1。

图1 LLC细胞生长状态 （光学显微镜×100）

2.2 CA 对LLC 细胞诱导的小鼠成瘤及一般状况的影响

至取材之日，低剂量CA 组、高剂量CA 组及对照组各有1 只小鼠死亡；中剂量CA 组死亡2 只，顺铂组死亡3 只。模型复制1 周后，各组小鼠长出肉眼可见的肿瘤组织，各组小鼠在模型复制2 周左右开始出现不同程度的脱毛，食欲不振，毛发干枯，不喜动，有的小鼠出现明显消瘦等情况，尤以顺铂组小鼠最为明显。而高剂量CA 组和低剂量CA 组小鼠脱毛、食欲不振及活动敏感度下降等情况比顺铂组好，毛色比顺铂组组有光泽。

2.3 CA对LLC细胞诱导的小鼠成瘤体积的影响

对照组、低剂量CA 组、中剂量CA 组、高剂量CA 组及顺铂组的肿瘤体积分别为（4.09±0.24）cm3、（3.09±0.58）cm3、（2.91±0.64）cm3、（2.59±0.89）cm3和（1.98±1.04）cm3，经方差分析，差异有统计学意义（F=26.652，P=0.010）。进一步两两比较，对照组肿瘤体积大于低剂量CA 组、中剂量CA 组及高剂量CA 组（P<0.05）；顺铂组肿瘤体积小于低剂量CA 组、中剂量CA 组及高剂量CA 组（P<0.05）；高剂量CA 组肿瘤体积小于低剂量CA 组和中剂量CA 组（P<0.05）。各组肿瘤体积随剂量增加体积逐渐缩小，对照组肿瘤生长最快，顺铂组肿瘤生长最慢。

2.4 CA对瘤重及抑瘤率的影响

对照组、低剂量CA 组、中剂量CA 组、高剂量CA 组及顺铂组瘤重比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。低剂量CA 组、中剂量CA 组、高剂量CA 组及顺铂组肿瘤重量逐渐减少，对照组瘤重最大，顺铂组瘤重最小。低剂量CA 组、中剂量CA 组、高剂量CA 组及顺铂组的抑瘤率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05），各组抑瘤率依次升高，顺铂组肿瘤生长最慢（P<0.05）。见表2。

表2 各组瘤重、抑瘤率的比较

2.5 各组小鼠LLC细胞病理形态学变化

对照组：细胞生长活跃，发现大量肿瘤细胞，核质粗、深染，核仁明显，核分裂象多见，可见大量细胞坏死，但细胞凋亡不明显（见图2）。低剂量组：细胞凋亡比例较低，但有凋亡现象，大部分细胞为坏死细胞（见图3）。中剂量组：细胞坏死和细胞凋亡现象均可见（见图4）。高剂量组：可见细胞坏死，凋亡现象多，间质可见红细胞渗出，细胞分裂象减少，可见散在许多凋亡小体（见图5）。顺铂组：可见肿瘤细胞出现明显的凋亡现象，可见形成的凋亡小体，细胞质深嗜伊红，细胞核浓染（见图6）。

图2 对照组LLC细胞病理学形态

图3 低剂量组LLC细胞病理学形态

图4 中剂量组LLC细胞病理学形态

图5 高剂量组LLC细胞病理学

图6 顺铂组LLC细胞病理学形态

2.6 各组LLC 细胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA 相对表达量的比较

对照组、低剂量CA 组、中剂量CA 组及高剂量CA 组LLC 细胞Survivin、Caspase-3、Bax mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较，对照组Survivin mRNA 相对表达量高于不同剂量CA 组（P<0.05），低剂量CA 组Survivin mRNA 相对表达量高于中剂量CA 组和高剂量CA 组（P<0.05）。对照组Caspase-3、Bax mRNA 相对表达量低于不同剂量CA 组（P<0.05），低剂量CA 组Caspase-3 、Bax mRNA 相对表达量低于中剂量CA 组和高剂量CA 组（P<0.05）。各组YAP mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 各组LLC细胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相对表达量的比较 （±s）

表3 各组LLC细胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与低剂量CA组比较，P<0.05。

组别对照组低剂量CA组中剂量CA组高剂量CA组F 值P 值YAP mRNA 1.613±0.247 1.229±0.037 1.381±0.207 1.484±0.195 3.019 0.128 Survivin mRNA 3.148±0.211 2.618±0.065①1.590±0.025①②1.304±0.098①②28.532 0.009 Caspase-3 mRNA 1.754±0.102 2.601±0.278①3.629±0.086①②3.861±0.088①②16.413 0.018 Bax mRNA 2.241±0.101 3.451±0.191①5.309±0.156①②6.182±0.050①②6.409 0.014

2.7 各组LLC 细胞Survivin、Caspase-3、Bax 及YAP蛋白相对表达量的比较

对照组、低剂量CA 组、中剂量CA 组及高剂量CA 组Survivin、Caspase-3、Bax 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较，对照组Survivin 蛋白相对表达量高于低剂量CA 组、中剂量CA 组及高剂量CA 组（P<0.05），低剂量CA 组Survivin 蛋白相对表达量高于中剂量CA组和高剂量CA 组（P<0.05）。对照组Caspase-3、Bax 相对表达量低剂量CA 组、中剂量CA 组及高剂量CA 组（P<0.05），低剂量CA 组Caspase-3、Bax蛋白相对表达量低于中剂量CA 组和高剂量CA 组（P<0.05）。各组YAP 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 各组LLC细胞中Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相对表达量的比较 （±s）

表4 各组LLC细胞中Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相对表达量的比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与低剂量CA组比较，P<0.05。

组别对照组低剂量CA组中剂量CA组高剂量CA组F 值P 值YAP蛋白1.113±0.047 1.166±0.068 1.043±0.032 1.101±0.079 3.391 0.110 Survivin蛋白0.892±0.0349 0.706±0.087①0.451±0.032①②0.319±0.025①②18.532 0.016 Caspase-3蛋白0.251±0.055 0.480±0.047①1.005±0.034①②1.298±0.094①②22.413 0.009 Bax蛋白0.243±0.045 0.295±0.089①0.631±0.056①②0.882±0.096①②16.409 0.018

3 讨论

肺癌目前仍是最常见的肿瘤之一[7]，其发病率和病死率均占肿瘤死亡患者的前位，2019年国家癌症中心关于恶性肿瘤流行情况分析报告指出肺癌的发病率和病死率仍居榜首，中国每年约有6 万患者因肺癌死亡[8]。最近研究表明，中药能在肿瘤的整个过程中发挥重要的预防和治疗作用。中药在预防和治疗肺癌中有自己的优势[9-10]。巴豆是一种流传于民间，用于抗癌的中草药，民间早已应用巴豆的提取物治疗恶性肿瘤，但关于巴豆提取物的具体抗癌机制研究较少。近年来，对巴豆及其提取物抗肿瘤作用机制的最新研究进展主要集中在以下几个方面：①影响膜系统分子动力学[11]；②诱导肿瘤细胞的凋亡：如CA 会抑制人卵巢癌细胞（HO-8910）的增殖，使其发生细胞凋亡[12]；③可诱导肿瘤分化和抗氧化、抑制肿瘤转移[13]；④可改变癌细胞的胞浆结构和破坏癌细胞的微管等[14]。以上机制相互影响相互作用，起到抗肿瘤作用。

目前肺腺癌发病率最高[15]，笔者前期已经进行了CA 对肺腺癌A549 细胞凋亡机制的体外实验研究，本研究通过体内实验进一步探讨CA 对肺腺癌生长的作用及具体的凋亡机制。本研究首先从复制动物模型开始，因小鼠的肺脏在分子特点、组织形态等方面与人类相似，而且两者的基因有90%以上同源性，所以复制小鼠肺腺癌模型更具有意义。本实验选用LLC 细胞，主要是由于LLC 肿瘤细胞来源于C57BL/6 小鼠的自发性肺肿瘤。将其接种于C57B/6 小鼠皮下，具有同种移植、成瘤率高、且生长较快等优点。本研究分两部分进行。第一部分为CA 对Lewis 小鼠肺腺癌细胞生长的研究：实验结果顺铂组小鼠死亡数目最多，可能是因为化疗药物副作用太大，不能耐受所致。顺铂组小鼠肿瘤生长虽然比对照组、低剂量CA 组、中剂量CA组、高剂量CA 组速度明显减慢，但出现体重下降，食欲差的现象，与临床上顺铂化疗后出现消化道副作用相符，可见顺铂对患者身体素质要求高，使用较局限。不同CA 组可抑制肿瘤生长速度，虽不如顺铂组明显，但小鼠生活状态良好。说明CA 更能提高生活总体质量。通过瘤重、瘤体体积及抑瘤率，发现CA 对Lewis 小鼠肺腺癌细胞的生长具有抑制作用，且随着CA 浓度的增加，抑制作用增强，说明CA 可以抑制肿瘤细胞生长，并与CA 浓度相关。继续增加CA 剂量后是否抑瘤效果更好？副作用更大？这一点可以通过后续的实验进一步证实。形态学观察发现，随CA 浓度的升高，肿瘤细胞凋亡率不断增加，但均没有顺铂组凋亡率高，说明CA 对肺腺癌细胞生长抑制作用不如顺铂组，但副作用较小。结果提示，在不能完全耐受顺铂治疗的患者中，可以尝试应用CA 进行联合治疗，减少顺铂用量，以减轻副作用。为进一步明确CA 通过何种途径促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长，本研究通过检测凋亡相关蛋白的表达，探讨其具体凋亡机制。

凋亡有内源性和外源性凋亡途径[16]，内源性途径在细胞凋亡中起到决定性作用[17]。Bax 属于Bax亚家族之一，具有促凋亡作用，在凋亡过程中扮演重要角色[18]；Survivin 是迄今发现最强的凋亡抑制因子[19]；Caspase-3 是一种终末剪切酶，在细胞凋亡过程中发挥重要作用[20]， 且Survivin 是Caspase-3 的直接抑制剂[21]；Hippo-YAP 信号转导通路在细胞中调节各类转录因子，调控细胞的增殖和凋亡[22-23]。本研究Survivin mRNA 在不同剂量CA组中的相对表达量低于对照组，CA 剂量越高，Survivin mRNA 的相对表达量越低；而Bax mRNA 和Caspase-3 mRNA 在不同剂量CA 组中的相对表达量高于对照组，CA 剂量越高，Bax mRNA 和Caspase-3 mRNA 的相对表达量越高；笔者猜测CA 对Lewis 小鼠肺腺癌细胞生长的机制与Bax 和Caspase-3 表达上调及Survivin 表达下调从而抑制细胞的增殖和凋亡有关；YAP 在各组中变化不明显，Hippo-YAP 信号转导通路不是CA 引起Lewis 小鼠细胞凋亡的主要通路，有可能是本研究的样本量太少，有待于进一步加大样本量进行研究。

综上，CA 可诱导Lewis 小鼠肺癌细胞凋亡，其可能的机制可能是因为Survivin 是Caspase-3 的直接抑制剂，Survivin 和Bcl-2 可能具有调节细胞凋亡的共同途径，CA 抑制了Survivin 的表达，从而使得Survivin 对Caspase-3 蛋白的抑制作用减弱，使得Caspase-3 的剪切增强，由于CA 可使Bax 表达增强，其与线粒体体外膜结合，将Cyt-c 释放到细胞质中，与其他细胞因子结合形成凋亡小体并募集和激活Caspase-3 蛋白，从而诱导Caspase 级联效应并因此促进细胞凋亡，起到抗肿瘤生长的作用。参与肺腺癌的凋亡相关因子众多[24-25]，如β-抑制蛋白2 基因，钙结合蛋白家族成员S100A6基因等，本研究仅从体内实验初步探讨CA 引起肺腺癌细胞凋亡的作用机制，以及阻止肿瘤复发和转移的机制，同时涉及多个分子和信号通路。仅用一个方面说明或评估肺腺癌细胞凋亡的发生机制无说服性，需要更深一步探讨，笔者认为可在此基础上运用高通量测序等高水平检测方法，进一步研究参与凋亡的其他凋亡蛋白和信号通路，以明确起最主要作用的凋亡蛋白和信号通路，为肺腺癌治疗提供新的思路。