2 种阿魏植物种质鉴别与幼苗生长比较

邵聪慧，赖晓辉

（伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆伊宁 835000）

阿魏是伞形科阿魏属（Ferula L.）植物的总称，有150 多种，以地中海、非洲北部、中亚及西伯利亚地区分布较广[1]。我国大约有26 种和1 变种[2]，主要分布在江苏、云南、山西和西藏等地，新疆有20 余种[3]，在北疆地区如塔城、乌恰、托里、伊宁、阜康等地种群分布较多[1]。该属有多种药用植物，在新疆民间使用得非常广泛。如：最早记录在唐代《新修本草》中的新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）和阜康阿魏（Ferula fukanensis K.M.Shen），通常把它们的根和树脂当作药物使用，研究表明，它们的根和树脂具有镇痛、解暑、抗炎、抗生育等多种药理作用[4-5]。

基于野生药用阿魏植物长年遭受滥砍滥伐，植物资源面临匮乏枯竭，人们已开始进行小面积种植阿魏药材。民间药用阿魏种植尚未规模化，阿魏市场鱼龙混杂，没有可靠种质来源，因此，种植前期和早期明确种质尤为重要。

大多数植物主要依靠传统的形态和生理特性进行物种鉴定。当种质形态差异较小时，传统的形态学鉴定方法比较困难。阿魏属植物是多年生一次性开花草本植物，属内多个种间外部形态非常相似，通常只能看到植株基生叶，仅根据叶片形态特征进行鉴定难度较大。然而，DNA 条形码技术是基于物种的，不受形态特征的限制，具有识别效率高、操作简单、易于在各个学科中应用的新型技术手段[6]。DNA 条形码技术是一种新的物种鉴定技术，它是一种分子诊断技术，通过在基因组中使用一个相对较短且被广泛认可的扩增的DNA片段来鉴定物种。近年来已成为生物分类鉴定的研究热点[7-8]。

许多实验证明了DNA 条形码ITS2 序列能够很好地鉴别芸香科、黄岑属、重楼属等很多科属植物，在许多科属中，ITS2 序列的鉴定效率高达100%[9-11]。已有实验利用ITS2 序列对阿魏属植物进行种质鉴定及亲缘关系分析[13]。

本实验以2 种阿魏种子为材料，使用ITS 序列进行2 种形态结构相似的阿魏属植物种子分类鉴定的基础上，再进行幼苗生长特性研究，鉴别比较2 个阿魏属植物不同种间的差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

本实验所用2 种阿魏种子采购于伊宁县农场，低温冷藏保存。实验主要仪器有：高压蒸气灭菌锅（BOXUN）、JY 电泳仪（JY600C）、凝胶成像系统仪（S/NA011011-004）、台式高速冷冻离心机（5430R）、PCR 仪（C1000Touch）、超低温储存冰箱（MDF-U3286S）等。

1.2 试剂

高效植物基因组DNA 提取试剂盒（天根DP350-02）、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（天根DP209-02）、PCR 试剂（大连宝）、琼脂糖、核酸染料EB、2000 DNA Marker。实验所用引物合成及测序均由北京华大基因公司完成。ITS2 序列扩增的通用引物[10]，正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。

1.3 基因组总DNA 提取

采用高效植物基因组DNA 提取试剂盒（DP350-02）法，分别提取2 种阿魏种子中基因组总DNA，并对提取物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。按照试剂盒步骤进行提取，操作步骤如下：

①材料预处理：将种子用蒸馏水冲洗干净，并用滤纸吸干水分，称取0.2g 放置于灭菌的研钵中，加入液氮充分碾磨成细粉状。

②将粉末分装至1.5mL 的离心管中，加入400μL的FGA 缓冲液和6μL 的RNaseA（10mg/mL），反复颠倒混匀1min，室温下放置10min。

③向离心管中加入130μL 的LP2 缓冲液，上下颠倒离心管充分混匀1min。

④12000rpm 高速离心5min，用移液枪吸取上清液至一个新的离心管中。

⑤在含有上清液的新离心管中加入2/3 体积的LP3 缓冲液（使用之前按瓶上标签的要求加入相应量的无水乙醇），立即颠倒离心管充分混匀15s，可能会有絮状沉淀出现。

⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀全部吸入到一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），然后12000rpm 高速离心30s，将收集管中的废液倒掉，吸附柱重新放回到收集管中。

⑦在上一步的吸附柱中加入600μL 的PW 漂洗液（使用之前按瓶上标签的要求加入相应量的无水乙醇），然后12000rpm 高速离心30s，将收集管中的废液倒掉，吸附柱重新放回到收集管中。此过程重复操作2次。

⑧12000rpm 高速离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放在室温条件下约20min，彻底晾干残余的漂洗液。

⑨将上一步的吸附柱放至一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加150μL 的TB 洗脱缓冲液，放置室温条件下2min，然后12000rpm 高速离心2min。

⑩重复上一步操作。将所得的离心液收集到一个新的离心管中，并保存于-20℃冰箱，防止DNA 降解。

1.4 PCR 扩增

以种子基因组总DNA 为模板，以ITS2 通用引物为扩增引物进行ITS2 序列扩增。PCR 反应体系为25μL，即：10μM 正、反向引物各1μL，10mM dNTP 1.5μL，25mM MgCl21.5μL，10×Buffer 2μL，DNA 模板3μL，Taq DNA 聚合酶0.2μL，加入ddH2O 补足至25μL。PCR 反应条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、退火温度56℃持续30s、72℃延伸45s、30 个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存。

1.5 扩增产物回收

扩增成功的产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，切掉多余的胶块，采用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（DP209-02）法对所获得的目的胶块进行回收，操作步骤如下：

①平衡吸附柱：向吸附柱CA2 中（吸附柱放入收集管中）加入500μL 的BL 平衡液，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

②称量并记录：将目的胶块放入1 个干净的离心管中，称量目的胶块的质量并记录下来。

③溶解胶块：向目的胶块中加入相同体积的PN溶胶液（若目的胶块质量为0.1g，就加入100μL 的PN溶胶液），放于水浴锅内，温度提前调至50℃。水浴期间上下不断颠倒混匀，至胶块完全溶解。

④将上一步所得溶液温度降到室温再加入到吸附柱（吸附柱放入收集管中），室温条件下放置2min，然后12000rpm 高速离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。

⑤向上一步吸附柱中加入600μL 的PW 漂洗液（使用前按瓶上标签的要求加入相应量的无水乙醇），然后12000rpm 高速离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。此过程重复操作2 次。

⑥12000rpm 高速离心1min，将吸附柱在室温条件下放置约20min，彻底晾干残余的漂洗液。

⑦将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL 的EB 洗脱缓冲液，室温条件下放置2min。

⑧12000rpm 高速离心2min，收集所得溶液。

⑨将离心所得的溶液重新吸入离心吸附柱中，室温条件下放置2min 再12000rpm 高速离心2min，收集离心液，即DNA 溶液，转移到一个新的离心管，并保存于-20℃冰箱。

将回收后的产物送往北京华大基因公司进行序列测定。为保证测序的准确性，采用正反双向测通。对于低质量的测序结果进行重新扩增测序。将待测样本ITS 序列提交至NCBI 网站中的GenBank 核酸数据库，采用分析相似性搜索法（BLASTn），并查找与待测样相似度最高的序列。

1.6 大田播种

选取新疆阿魏生境地附近农田作为实验田，前期整好地。将2 种阿魏种子浸水24h 后，置于4℃冰箱低温层积处理50d，选取种子胚根突破种皮者于3 月下旬进行穴播，播种深度2～3cm，株距为50cm，行距50cm，幼苗生长期间适当进行除草。待种子萌发生长50d 后统计2 种阿魏幼苗株高及真叶数，使用SPSS 进行数据分析，采用两独立样本T 检验方法进行样本间差异比较，显著性水平为0.05，使用Graphpad 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 种子总DNA 及扩增产物电泳检测

种子总DNA 用1%琼脂糖凝胶电泳检测：条带清晰无杂质（如图1 所示），可用于后续PCR 实验。

图1 阿魏种子总DNA 琼脂糖凝胶电泳

ITS2 扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰明亮，无杂质（如图2所示），可用于切胶回收，回收产物再经电泳检测合格，送样测序。

图2 扩增产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 扩增产物回收检测

吸取2μL 切胶回收产物，与1μL 的6×Lodding Buffer 反复吹打混匀，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰明亮，无杂质（如图3 所示）。回收后的产物可用于后续测序。

图3 切胶回收产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 ITS2 序列的同源性分析

对成功测序的2 条ITS2 扩增序列进行在线BLAST 比对。结果显示，1 号样品ITS2 序列分别与GenBank 数据库中新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）登录号为JX667752.1 序列同源性最高，为99.9%，2 号样品ITS2 序列与GenBank 数据库中山地阿魏（Ferula akitschkensis B.Fedtsch.ex K.-Pol.）登录号为KP406810.1 序列同源性最高，为99.9%（如图4 所示）。由此推测，2 种阿魏分别是新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）和山地阿魏（Ferula akitschkensis B.Fedtsch.ex K.-Pol.）

图4 ITS2 扩增序列进行在线BLAST 比对

2.4 2 种阿魏幼苗生长情况比较

对新疆阿魏和山地阿魏50d 幼苗进行株高测量与真叶数统计（如表1 所示）。2 种阿魏幼苗株高均服从正态分布，如表2 所示，且方差齐，进行独立样本t 检验，P＜0.05，2 种阿魏50d 幼苗株高存在显著差异（如表3）。新疆阿魏幼苗平均株高为7.9451±2.0cm，山地阿魏平均株高为6.1313±2.0cm，新疆阿魏幼苗植株显著高于山地阿魏（如图4）。

表1 株高及真叶数统计描述

表2 株高数据正态性检验

表3 2 种阿魏幼苗株高独立样本t 检验

2 种阿魏50d 幼苗的真叶数：新疆阿魏平均真叶数2.69 枚，山地阿魏平均2.48 枚。对2种阿魏50d 幼苗真叶数进行独立样本t 检验，P＞0.05，不存在显著差异，说明幼苗期2 种阿魏幼苗真叶生长情况差异较小，无法进行区分，不能作为幼苗期种质鉴定指标。

图5 2 种阿魏50d 幼苗株高比较

3 结论与讨论

本实验是以2 种阿魏的种子为材料，利用分子生物学的手段，获得种子基因组DNA，利用ITS2 部分序列，进行BLAST 比对，分别匹配出与2 种阿魏ITS 序列同源性最高的2 个种，最终确定2 种阿魏种子为新疆阿魏和山地阿魏。同时，比较2 种阿魏幼苗期生长情况，再次证明本次2 个待测样品种子为阿魏属不同种。本实验为药用植物阿魏人工栽培前种质鉴定提供基础，避免药材种植过程中种质鱼龙混杂，降低药材品质。但在实验过程中，提取的阿魏种子DNA 质量不是很高，可能是种子细胞较难破碎，也可能是种子内种皮、胚或胚乳当中的次生代谢物较多，影响DNA 高质量提取。因此，阿魏种子DNA 提取方法有待进一步优化。同时，阿魏属植物幼苗期更多种质鉴定指标有待后续试验探索。近年来，植物的传统形态学鉴定和通过DNA 条形码进行植物种、属鉴定之间存在很多分歧，需要在进行物种分类鉴定时多方面综合研究。结合传统鉴别方法和现代分子生物学手段，在植物种子鉴定方面使分类鉴定结果更加准确。