液相色谱－串联质谱法测定鳙鱼中硝基呋喃代谢物含量的方法研究

文 史君 吕永恒 孟桂芳 秦臻 邹城市检验检测中心

在阴性鳙鱼中加入盐酸溶液和2-硝基苯甲醛后，以现行标准中37℃衍生16h为对照，优化衍生温度和衍生时间，45℃衍生4h。而后乙酸乙酯液-液萃取浓缩，初始流动相复溶，经液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。通过验证，（45℃；4h）的衍生条件，在校准曲线、准确度、精密度、灵敏度的表现上和标准方法接近，说明该衍生条件不但能够满足鳙鱼中硝基呋喃类代谢物的测定，还缩短了前处理时长，大大提高了检测效率。

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，曾广泛应用于畜禽及水产养殖业。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎的副作用，2019年12月27日，硝基呋喃被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单（中华人民共和国农业农村部公告 第250号）。

硝基呋喃类药物在脊椎动物体内会迅速分解，生成相应的代谢物，而代谢物容易和动物组织中蛋白质结合并长期残留，故常利用代谢物的检测来反应硝基呋喃类药物的残留状况。

目前，国家现行标准中，通过液相色谱串联质谱方法来测定硝基呋喃代谢物是主流方法。本文通过优化衍生温度与衍生时间，缩短了整个衍生过程，建立了鳙鱼中硝基呋喃代谢物测定的快速前处理方法。通过3个高中低水平的加标回收试验验证该前处理方法的精密度与准确度。

1. 材料与方法

1.1 仪器与设备

液相色谱-质谱联用仪（SCIEX 4500）；电子分析天平（Mettler Toledo MS204S)；pH计（Mettler Toledo FiveEasy Plus）；水浴恒温振荡器（常州润华电器有限公司SHABA）；高速离心机（cence H1850）；涡旋振荡器（IKA MS3 digital）。

1.2 材料与试剂

AOZ标准品（农业部环境保护科研检测所，100μg/mL)；AMOZ标准品（农业部环境保护科研检测所，100μg/mL）；AHD标准品（农业部环境保护科研检测所，100μg/mL）；SEM标准品（农业部环境保护科研检测所，100μg/mL）；AOZ-D标准品（农业农村部农产品质量标准研究中心，100μg/mL）；AMOZ-D标准品（农业农村部农产品质量标准研究中心，100μg/mL)；AHD-C标准品（农业农村部农产品质量标准研究中心，100μg/mL)；SEM·HCl-CN标准品（农业农村部农产品质量标准研究中心，100μg/mL)；2-硝基苯甲醛（色谱纯）；二甲亚砜（色谱纯）；乙酸乙酯（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；无水磷酸氢二钾（优级纯）；盐酸（优级纯）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

分别准确吸取AOZ、AMOZ、AHD、SEM标准品适量，用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液。准确吸取4种标准储备液，用甲醇逐级稀释成100μg/L和10μg/L的混合标准溶液。

分别准确吸取AOZ-D、AMOZ-D、AHD-C、SEM·HCl-CN标准品适量，用甲醇配制成1.0mg/mL的标准储备液。准确吸取4种标准储备液，用甲醇逐级稀释成100μg/L的混合内标标准溶液。

1.3.2 测定步骤

取试样2.00g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入50μL混合内标标准溶液（100μg/L）、5mL盐酸（0.5mol/L）、150μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），涡旋混合1min。在水浴恒温振荡器中，将衍生时间和衍生温度分别设置为（37℃；16h）和（45℃；4h）。取出离心管冷却至室温，用磷酸氢二钾溶液（1.0mol/L）调pH至7.0-7.5，加入8mL乙酸乙酯，涡旋振荡30s，6000r/min离心5min，取上清液至10mL玻璃离心管中，40℃氮气吹干。用初始流动相复溶后，过膜上机测定。

1.3.3 标准曲线制备

分别准确移取10μg/L和100μg/L混合标准工作液各0.05mL、0.1mL、0.2mL于6个50mL离心管中，除不加样品外，按照1.3.2测定步骤进行处理，最终浓度为0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L。按1.3.4上机测定，每个浓度点测定2次。

1.3.4 仪器条件

液相色谱条件：色谱柱C（150mm×3.0mm，粒径5μm）；流动相洗脱条件见表1。质谱条件：ESI+，具体参数见表2。

表1 流动相梯度洗脱程序

表2 四种硝基呋喃代谢物及其内标的质谱参数

1.3.5 线性范围的验证

按照1.3.3步骤进行标准曲线线性范围的验证。对于准确定量的方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99。

1.3.6 灵敏度的验证

在对应标准中，硝基呋喃类代谢物在水产品中的检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。分别在检测限及定量限水平上进行加标，重复测定10次，验证信噪比是否符合要求（检测限S/N≥3；定量限S/N≥10）。

1.3.7 准确度的验证

根据《中华人民共和国农业农村部公告第250号》规定，硝基呋喃类代谢物为禁用药物，在动物性食品中不得检出。因此，在检测限、2倍检测限和10倍检测限进行验证，即0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg三个浓度水平上进行加标回收试验，按照1.3.2进行前处理，1.3.4进行上机测定，每个加标水平重复测定10次。回收率应在60%-120%之间。

1.3.8 精密度的验证

根据《中华人民共和国农业农村部公告第250号》规定，硝基呋喃类代谢物为禁用药物，在动物性食品中不得检出。在对应标准中，硝基呋喃类代谢物在水产品中的检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。因此，在检测限、2倍检测限和10倍检测限进行验证，即0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg三个浓度水平上进行试验，按照1.3.2进行前处理，1.3.4进行上机测定，每个水平重复测定10次，计算RSD。RSD应小于15%。

2. 结果与分析

2.1 标准曲线线性范围

以目标物的浓度为横坐标，对应浓度目标物峰面积与相应同位素内标峰面积比值为纵坐标，得到各目标物的标准曲线线性方程及相关系数（见表3）。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的线性方程及相关系数表

由表3可以看出，四种硝基呋喃代谢物的线性方程相关系数均大于0.99，相关性良好，可用于准确定量。

2.2 灵敏度

在检测限和定量限水平上加标，重复10次。经检测发现，检测限水平上的加标测定，S/N＞3；定量限水平上的加标测定，S/N＞10。由此可见，本产品的检测限和定量限均满足实验室要求。

2.3 准确度和精密度

在检测限、2倍检测限和10倍检测限进行验证，每个水平重复测定10次，结果数据见表4。

表4 AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的精密度及添加回收率

由表4可以看出，四种化合物的添加回收率在60%-120%，相对标准偏差＜30%，满足要求。

3. 结果与分析

现行标准中，鳙鱼中硝基呋喃代谢物测定的衍生时间为16h，造成整个前处理时长较长。本文通过验证发现，（45℃；4h）的衍生条件，不但在校准曲线、灵敏度、准确度、精密度方面表现良好，能够满足鳙鱼中硝基呋喃代谢物测定要求的同时，还大大缩短了前处理时长，提高了检测效率，让硝基呋喃代谢物的检测在一天内完成已成为可能。