高糖微环境下EMD对钛表面BMSCs成骨分化的影响及其机制研究

孟茂花 夏茜 成璐 李英 陈镜桥 王勤英 叶朝阳 董强

糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者种植体周围炎发生的概率较高，与健康患者相比，骨结合较慢，种植体的存留率相对较低，种植术后并发症的控制和治疗较难，因此，糖尿病是口腔种植修复关注的主要基础疾病之一[1]。釉基质衍生物(enamel matrix derivatives，EMD)是从幼猪牙胚中提取的釉基质蛋白的衍生物，主要由釉原蛋白、成釉蛋白和类生长因子物质等共同构成, 在口腔相关基础研究和临床治疗中，体现出较好的组织再生效果[2]。有研究发现，EMD可以促进糖尿病大鼠颌骨缺损的骨组织再生[3]， EMD治疗种植体周骨缺损，10 年种植体存留率为90.7%，同时在种植体骨缺损治疗中获得长期稳定的效果[4]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可定向分化，是良好的种子细胞，经过处理和诱导后，能促进牙周组织缺损修复，在牙周组织再生中有较好的治疗前景[5]。BMSCs是牙槽骨损伤修复的重要细胞，有较好的归巢功能[6]，在种植体植入后，BMSCs通过血液募集到种植体表面，为种植体提供较好的骨结合条件。因此，在DM患者种植体周围骨缺损修复的过程中，BMSCs在损伤部位的成骨和黏附起着至关重要的作用。经典的Wnt/β-catenin信号通路是BMSCs成骨分化的重要通路，即使在高糖微环境下也是如此[7]。

喷砂酸蚀(sandblasted and acid-etched，SLA)是钛种植体常用的表面改性技术之一，其细微粗糙的表面促进细胞黏附[8]。EMD可以促进SLA钛表面牙龈成纤维细胞[9]和成骨细胞[10]的增殖、黏附和成骨分化。因此推测EMD是否也能促进高糖微环境下BMSCs在SLA钛表面上的成骨和黏附的性能？目前，EMD在高糖微环境下，对SLA钛表面BMSCs的成骨分化和黏附的作用及其机制尚不清楚。本课题组前期研究发现，EMD可以促进正常糖状态下的BMSCs的成骨分化，并且可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来实现的[11]。本研究体外采用5.5 mmol/L正常糖(normal glucose，NG)和25 mmol/L高糖(high glucose，HG)，通过细胞迁移、碱性磷酸酶活性、茜素红半定量、电镜扫描、RT-qPCR和WB的检测方法，在SLA钛表面上对BMSCs进行成骨和黏附性能检测和分析，EMD在高糖微环境下，对SLA钛表面BMSCs的成骨和黏附的作用及其机制进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

10 只2 周龄SD大鼠(SPF级)；EMD(Straumann,瑞士)；DMEM (Gibcol，美国)；胎牛血清、青-链霉素(Biological Industeries,以色列)；成脂诱导分化培养基[赛业(苏州)生物科技有限公司]；Anti-Runx2 (CST，美国)；一抗Osterix、β-catenin、Fibronecti、Integrinβ1(Abcam，英国)；Anti-Col-1(北京博奥森生物技术有限公司)； XAV-939(MedChemExpress,美国)；抗体CD45、CD90、CD29、CD11b(BioLegend，美国)；Trizol、PrimeScript®RT反转录试剂盒(Takara，日本)；SYBRTMGreenMasterMix和ECL化学发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)；PVDF膜(Millipore，美国)；SLA钛片(西安泰金工业)；ALP活性测定试剂盒(南京建成)；氯化十六烷基吡啶一水(大连美仑生物技术有限公司)；二抗(泰安普美生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs提取及鉴定 SD大鼠脱颈处死，剥离胫骨和腓骨，PBS冲洗骨髓腔，收集细胞，贴壁筛选法分离培养，取第3代用于后续试验。流式细胞技术进行CD29、CD90、CD45、CD11b检测。成骨诱导(10%FBS，1%青-链霉素，50 μmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸钠、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 nmol/L地塞米松)21 d，1%茜素红染色。SD大鼠干细胞成脂诱导分化培养基，21 d油红O染色。

1.2.2 SLA钛片培养细胞 用直径10 mm，厚1 mm，SLA表面处理的钛片，放入48 孔板，按2×105/孔，成骨诱导，用于后续检测。

1.2.3 EMD试剂工作浓度配制 EMD为30 mg/mL，工作浓度为75 μg/mL，取EMD加入培养基中，涡旋震荡混匀。

1.2.4 细胞迁移实验 取BMSCs，3×103/孔，200 μL DMEM重悬，加入Transwell小室中。24 孔板孔内加入800 μL培养基(NG，HG，HG+75 μg/mL EMD)，培养48 h，4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色。

1.2.5 ALP活性检测 BMSCs在SLA钛表面成骨诱导7 d，提取蛋白，BCA蛋白定量，使用ALP活性检测试剂盒，520 nm波长，酶标仪测定A值。

1.2.6 茜素红半定量实验 BMSCs在SLA钛表面成骨诱导21 d，4%多聚甲醛固定，茜素红染色，每孔加200 μL 10%氯化十六烷基吡啶37 ℃摇床孵育1 h，取100 μL加入96 孔板中，562 nm波长，酶标仪测定A值。

1.2.7 电镜扫描 BMSCs在SLA钛表面成骨诱导28 d，2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，酒精(50%、70%、80%、90%)逐级脱水，使用100%酒精脱水3 次，在钛片表面喷金，扫描电镜(SEM)拍照观察。

1.2.8 RT-qPCR BMSCs在SLA钛表面成骨诱导7 d，收集细胞，Trizol法提取总RNA，检测纯度和浓度后进行定量，逆转录成cDNA，使用SYBR Green荧光定量聚合酶链式反应检测试剂盒进行RT-qPCR，相关基因引物序列均由中国上海生工生物有限公司合成，以β-actin为内参，检测各组mRNA相对表达量(表 1)。

1.2.9 Western blot BMSCs在SLA钛表面成骨诱导7 d，收集细胞，提取蛋白。10% SDS-PAGE电泳，0.45 μm PVDF膜，5%BSA封闭1 h，一抗孵育过夜，二抗孵育1 h，化学发光仪曝光，保存蛋白条带，Image J检测蛋白条带的灰度值。

表 1 引物序列设计

1.2.10 Wnt/β-catenin信号通路抑制剂 细胞分组：NG，HG，HG+EMD、NG+XAV-939、HG+XAV-939、HG+EMD+XAV-939)，使用10 μg/mL XAV-939[12]，成骨诱导7 d，WB检测成骨和黏附相关蛋白的表达变化。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析并作图，以P<0.05为差异具有统计学意义，所有实验重复3 次。

2 结果

2.1 BMSCs鉴定

细胞贴壁，呈纤维样和漩涡样生长 (图 1A、B)。茜素红染色可见红色矿化结节(图 1C)，油红O染色可见脂滴形成(图 1D)。干细胞表面标志物 CD29和CD90表达呈阳性，非干细胞相关的标志物CD45和 CD11b表达呈阴性(图 1E)。

图 1 BMSCs培养及鉴定(A～D, ×100)

2.2 EMD在高糖微环境下促进BMSCs迁移

Transwell检测EMD在高糖微环境下对BMSCs迁移的影响(图 2A)，迁移细胞计数(图 2B)，HG组低于NG组，HG+EMD组数量有明显上升，表明在高糖微环境下BMSCs迁移受到抑制，EMD可以改善迁移抑制。

图 2 Transwell细胞迁移

2.3 BMSCs成骨分化

使用ALP活性检测早期成骨标志物(图 3A)，HG组低于NG，添加EMD后活性有明显上升。茜素红染色半定量(图 3B)检测成骨晚期矿化程度，HG组较NG组减低明显，EMD诱导后，矿化程度有上升。

图 3 成骨分化能力检测

2.4 矿化结节表面形态

SEM观察SLA钛片表面BMSCs矿化结节(图 4)，NG组的矿化结节较大，突出钛片表面较高，矿化面积最多，NG组明显降低，EMD作用后矿化面积增加。

图 4 SLA钛表面矿化结节(SEM)

2.5 WB检测成骨和黏附蛋白

WB检测成骨和黏附相关的蛋白的表达(图 5A)和灰度值(图 5B)，HG组较NG组成骨和黏附相关蛋白(Osterix、Runx2、COL-1、Integrin β1和Fibronectin)显著降低，HG+EMD组有不同程度的增加。

2.6 RT-qPCR检测成骨和黏附相关基因

RT-qPCR检测Osterix、Runx2、COL-1、Integrin β1和Fibronectin基因表达(图 5C)，HG组成骨和黏附的mRNA的表达低于NG组，HG+EMD组升高。

2.7 β-catenin基因与蛋白表达

WB和RT-qPCR检测β-catenin的蛋白和mRNA表达(图 6)；HG组β-catenin蛋白表达较量最少，EMD作用后增高，基因表达趋势与蛋白相一致。

图 6 β-catenin基因和蛋白的表达

2.8 XAV-939处理后下游的蛋白的表达变化

WB检测XAV-939处理后Wnt/β-catenin信号通路下游的成骨和黏附相关蛋白(图 7A)和灰度值(图 7B)，HG组较NG组的蛋白(Osterix、Runx2、β-catenin、Integrin β1和Fibronectin)表达降低，HG+EMD表达增加，趋势与之前的检测相符合。XAV-939组的蛋白均呈下降趋势，下游的成骨和黏附相关蛋白(Osterix、Runx2、Integrin β1和Fibronectin)表达均降低(P<0.05)，表明即使在高糖微环境和XAV-939的共同作用下，EMD仍可以促进SLA表面BMSCs的成骨和黏附。

图 7 XAV-939处理后Wnt/β-catenin信号通路下游成骨和黏附相关蛋白的表达变化

3 讨 论

目前，为牙列缺损的糖尿病患者进行种植义齿修复，能够获得长期有效的临床治疗效果，已是常规的口腔修复方式之一。但是，由于高血糖可能对种植体骨结合以及术后并发症的不利影响，与正常患者相比，糖尿病患者的种植体长期存留率及术后维护都具有挑战性。如何进一步改善和避免高血糖对口腔种植的不利影响？一直是口腔种植领域的关注热点之一。

本研究通过体外培养，进行细胞形态观测、成骨分化和成脂分化能力的鉴定，以及干细胞表面标志物的鉴定(图 1)，证明提取细胞为BMSCs[12]。根据本课题组前期研究，在25 mmol/L葡萄糖微环境条件下，EMD诱导BMSCs增殖和成骨分化的较佳浓度为75 μg/mL，故使用该浓度进行本实验研究[13]。BMSCs在种植体表面的迁移、黏附和成骨的能力，是种植体骨结合成功的关键[14]。本研究通过Transwell检测EMD在高糖微环境中对BMSCs迁移的影响(图 2)，结果提示，BMSCs迁移能力受到抑制，EMD能缓解高糖微环境对BMSCs迁移能力的损伤。ALP活性、茜素红半定量(图 3)和电镜扫描(图 4)结果提示，虽然SLA钛表面可以增加BMSCs细胞外基质的分泌以促进成骨分化[15]，但在高糖微环境中，SLA钛表面BMSCs的成骨能力受到抑制，EMD可部分改善BMSCs的成骨能力。

Runx2是成骨早期的重要转录因子，Osterix 是成骨细胞才表达的转录因子，两者在BMSCs成骨分化过程中占据重要的地位[16]。COL-1可以促进细胞外基质的分泌，在成骨分化过程中使细胞外基质矿化，有利于种植体表面BMSCs的成骨和黏附，是Runx2和Osterix 成骨分化过程转录的重要下游蛋白[17]。本研究通过RT-qPCR和WB检测成骨分化的几个关键指标(Osterix、Runx2和COL-1)mRNA和蛋白的表达(图 5)。高糖微环境下，Osterix、Runx2和COL-1的表达都分别相应下调，EMD作用后，均分别出现上调，其表达趋势与ALP活性和茜素红半定量结果趋势相符合。

Integrin β1为整合素家族的重要蛋白，细胞通过整合素蛋白与生物材料相结合，Fibronectin为黏连蛋白，促进细胞外基质在种植体表面的沉积和矿化[18-19]。本研究通过RT-qPCR和WB检测Integrin β1和Fibronectin的基因和蛋白表达(图 5)，在高糖微环境下其表达均下调，EMD作用下促进Integrin β1和Fibronectin表达上调。

Wnt 信号通路是由Wnt家族的配体蛋白和Frizzled家族跨膜受体蛋白结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，根据是否依赖β-catenin蛋白，分为经典Wnt/β-catenin途径和非经典途径；其中，经典Wnt/β-catenin途径通过β-catenin在细胞质中积累，易位至细胞核后与T细胞因子/淋巴增强因子结合，启动转录下游的靶基因[20]。本研究通过RT-qPCR和WB检测β-catenin基因和蛋白(图 6)，其与Osterix、Runx2、COL-1、Integrin β1和Fibronectin表达趋势一致；添加通路抑制剂XAV-939，WB结果显示(图 7)，下游成骨和黏附蛋白均相受到抑制，其中，HG+XAV-939组最为显著。

综上所述，在本实验研究的高糖微环境中，SLA钛表面BMSCs成骨和黏附均受到抑制，EMD作用下可改善其抑制效应。EMD对SLA钛表面BMSCs的成骨分化和黏附的促进作用，可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关，其具体作用机制还需进一步研究。