坦不苏病毒的研究进展

文│沈思思（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院）

坦不苏病毒（TMUV）属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链RNA虫媒病毒，1955年首次在马来西亚吉隆坡被发现并分离出来。但它与人类或动物健康的相关性尚未完全揭示。黄病毒属有许多成员，包括登革热病毒（DENV）、黄热病病毒（YFV）、日本脑炎病毒（JEV）和寨卡病毒都是人畜共患病和重要的媒介传播病毒，每年导致数百万人感染，从轻微发热症状到出血性或神经疾病。在自然界中，鸟类通常是许多黄病毒的扩增宿主和贮存宿主。2010年4月，在中国鸭TMUV首次被确定为鸭产蛋下降综合征的病原体，该病的特点是产蛋量大幅下降，受感染的产蛋鸭和种鸭的采食量突然下降，还出现了神经症状、卵巢出血、卵泡闭锁和淋巴细胞浸润等主要病理变化。感染率和发病率很高，总死亡率为5%～15%。禽TMUV已在家禽业造成严重的经济损失，由于黄病毒的人畜共患病特性，禽TMUV可能会引起公共卫生问题。因此，笔者总结了禽TMUV病毒基因组特征、宿主范围、流行病学和系统发育、临床症状、检测方法以及治疗的研究进展，以期为后续研究提供参考。

一、基因组特征

坦不苏病毒是单股正链RNA病毒，基因组长度约为11kb，有一个开放阅读框，两侧是5′端和3′端非编码区（UTR）。5′端有m7GPPaMP结构，3′端没有poly A尾。通过病毒和细胞蛋白酶的后续切割，多聚蛋白被加工成基因组5′端的3种结构蛋白：衣壳（C）蛋白、前膜（PrM）蛋白和包膜（E）蛋白；7种非结构（NS）蛋白编码：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白形成病毒颗粒并参与病毒与宿主细胞的融合，在病毒受体结合、进入和融合中发挥重要作用，而NS蛋白参与病毒RNA复制、病毒粒子组装和先天免疫逃避反应。

二、宿主范围

TMUV宿主范围广泛，包括蚊子、鸡、鸭、鹅、鸽子和麻雀等。产蛋下降综合征影响了肉鸭、蛋鸭及多种品种鸭，包括北京鸭、绍兴鸭、龙岩鸭、番鸭和家养野鸭等。体外实验室研究表明，鸭TMUV在广泛的哺乳动物细胞系（即Vero、BHK21、HeLa、HepG2和SH-SY5Y）、禽源细胞系（即DEF、GEF和DF-1）和蚊媒细胞系（即C6/36和白纹伊蚊）中复制良好。此外，一项人工感染研究发现，BALB/c小鼠和昆明小鼠在脑内接种后对鸭TMUV敏感，但对皮下或鼻腔接种不敏感，病理变化与许多其他脑炎性黄病毒的典型特征相似，严重可导致死亡。该病毒在大脑和脾中大量复制。此外，一项针对鸭业工人的调查报告显示，70%以上的受试血清样本中检测到鸭TMUV抗体，其中约50%的口腔拭子样本对TMUV RNA呈阳性，表明其可能从鸭传播到人或从鸭传播到其他非禽宿主上。随后的体内研究表明，鸭TMUV不能在皮下接种的恒河猴上引起病毒血症或临床症状，但可以通过感染诱导引起鸭TMUV特异性体液免疫反应。这些数据表明，鸭TMUV在体内和体外的多种非禽类细胞中复制良好，但鸭TMUV引起人类疾病的风险没有其他黄病毒高。

三、流行病学和系统发育

2010年TMUV首次在中国东南部鸭子中被确诊为未知原因引起的鸭产蛋下降综合征，同年，该病迅速蔓延到中国大部分养鸭地区，包括许多沿海省份和周边地区及北京市、河北省、山东省、江苏省、安徽省、浙江省、江西省和福建省等。随后，中国西南部和南部报告的病例数量不断增加，包括2012年的广东省和广西壮族自治区、2013年的重庆市和2015年的上海市。TMUV感染鸭的临床症状包括精神沉郁、生长迟缓、食欲减退，甚至瘫痪或死亡。被感染的产蛋鸭产蛋数量严重减少（产蛋量减少20%～60%，偶尔高达90%），病理剖检观察到严重的卵巢出血、卵巢炎和卵巢退化。此外，分子系统发育分析将中国分离的所有TMUV归为一枝。

马来西亚该分离株更接近所有中国TMUV菌株。但蚊媒传播的TMUV并没有被证明是人类和动物疾病的病原体。直到2012年，在马来西亚的几个养鸭场，4～7周龄的肉鸡鸭群中出现了几次以共济失调、跛足和进行性瘫痪为特征的神经系统疾病。在进行大体病理学和组织学观察、病毒分离、雏鸭繁殖和基因组测序后，确认该病的病原为马来西亚鸭坦不苏病毒，其基因组RNA序列与中国的相关鸭TMUV相似。

2002年，一项研究报告显示，在泰国同一地区的库蚊和哨兵鸭中检测到TMUV。但直到2013年才有关于TMUV在鸟类中感染的疾病报告，当时泰国养鸭场新出现了一种严重的减蛋综合征传染病。这种疾病迅速蔓延，给养鸭业造成了巨大的经济损失。最终被确诊为鸭TMUV。根据系统发育分析，泰国的TMUV与马来西亚的传统鸭TMUV和中国新分离的鸭TMUV相同。

四、临床症状

TMUV是一种由蚊媒传播的病毒性黄病毒，与WNV和Usutu病毒（USUV）一样，其自然维持周期涉及鸟类和蚊子。鸟类感染的病因以流涕、腹泻、厌食和社会行为紊乱等突发性急性症状为特征。受感染的动物还表现出严重的神经系统疾病，包括脑炎、行动困难、共济失调和瘫痪。养殖场感染率可达到90%，具体取决于饲养条件，死亡率5%～30%不等，并可能因继发感染而增加。脾、肝、肾和大脑通常出现肉眼可见的病变。组织学分析显示，感染器官出现了多种微观变化，包括出血、炎症、增生、巨噬细胞和淋巴细胞浸润等。在种鸭常见临床表现为卵巢受损，伴有大量炎症、出血和充血，并伴有器官退化。TMUV感染可导致胚胎退化和排卵量急剧下降，这被称为产蛋下降综合征，造成养鸭业的重大经济损失。最近的一项研究报告称，所有年龄段的鸭子都可能感染TMUV。尽管在一些鸭群中，幼龄动物的感染程度更严重，但在老种鸭中易感性更高。此外，老龄的被感染鸭病毒脱落期较长，载量较高，没有临床症状，是隐性携带者，表明这些动物在疫情暴发期间发挥了重要作用。

目前已经证实TMUV是一种鸟类嗜神经病毒，尽管在神经元水平上的扩散机制仍知之甚少。最近一项关于雏鸭模型的研究揭示了血脑屏障进入中枢神经系统的方式。早期几乎没有临床症状，尽管病毒在大脑中复制并由此诱导炎性细胞因子，但血脑屏障似乎不易被病毒渗透。因此，有必要等到感染晚期才能看到与血脑屏障破坏和微血管内皮细胞扩散相关的神经症状，导致感染动物的炎症和致命性脑炎。

虽然TMUV感染禽类的症状得到广泛描述，但很少感染其他脊椎动物宿主。2020年，Yurayart等报告，TMUV感染小鼠脑内的神经发病机制和全球传播。这些动物表现出广泛的临床症状，导致死亡的严重内部器官损伤。Tang等调查了禽类养殖场工人中TMUV感染情况，收集口腔拭子和血清样本进行TMUV分子检测和血清学筛查。分子方法为半巢式RT-PCR，而血清学检测方法为IgG ELISA和病毒中和试验。超过70%的血清样本为阳性，TMUV可以从48%的口腔拭子中分离出来。感染工人也表现出无症状。TMUV对人类有潜在的传播风险，建议将TMUV视为一种新出现的人畜共患病病原体，尽管与其他禽类黄病毒成员一样，人类传播事件没有进一步的人传人现象。泰国最近的一项研究报告也称，人类对TMUV血清呈阳性，并且没有临床症状。这项研究强调了对人类，特别是接触禽类动物的高风险人群进行前瞻性监测和调查的重要性。还需进一步的研究来更好地评估哺乳动物的潜在结果，尤其是神经表现及其在传播中的作用。

五、检测方法

自从首次分离出TMUV以来，已经开发了几种检测技术用来诊断该病毒。诊断工具的开发是为了防止养殖场大规模疫情暴发，保护家禽业免受经济损失。在生产和出口大量家禽的国家预防疫情暴发是一个重大问题，尤其是对我国来说，因为我国是世界上第一大鸭子生产国。

Kono等通过电子显微镜观察到在感染TMUV的转化鸡B淋巴细胞系BK3（LSCC-BK3）中的病毒颗粒。虽然病毒分离和电子显微镜仍然是最佳诊断方法，但它们不适合用于诊断目的。电子显微镜的观察非常耗时，需要配备一台昂贵的设备和训练有素的高技能人员及专用实验室，这使得无法在实验室之外进行检测。此外，必须使用新鲜标本来获得活病毒。

目前，常见的TMUV诊断方法包括基于NS1蛋白检测的酶联免疫吸附试验血清学检测和中和试验。E蛋白的空间结构在DENV、WNV和JEV中得到很好的描述，显示了黄病毒之间的高度相似性，由于这种糖蛋白暴露在病毒粒子表面，具有免疫原性。事实上，E蛋白已被广泛用于生产单克隆或多克隆抗体。最近有报道称，一种新的中和抗体（1G2）与JEV、WNV和ZIKV交叉反应，靶向位于E蛋白结构域II中的一个最小表位，在小鼠中对TMUV有很大的保护作用，表明其在检测中的潜在用途，以及在诊断和治疗中的一个有价值的候选者。逆转录酶结合聚合酶链式反应（RTPCR）通常用于检测病毒的存在，目前，开发了几种针对几种禽病毒的多重PCR方法。最后，开发了一种新的检测方法，使用逆转录酶PCR结合质谱检测来筛查特定鸭病毒的存在。利用这项技术可以同时以较低的检测阈值识别养鸭业中的各种病毒感染。

为确保其传播，TMUV必须先在蚊媒载体中复制。在胚胎鸡蛋中分离病毒的同时，C6/36蚊媒细胞系被用于病毒分离。但由于缺乏脊椎动物宿主中病毒的信息，导致使用原代细胞和细胞系来研究病毒的生物学特性。不同类型的禽类细胞已被用于研究TMUV的生物学特性，包括BK3细胞、转化的鸡B淋巴细胞细胞系、鸡巨噬细胞衍生细胞系HD-11和鸡胚成纤维细胞分离的DF1细胞系。除了用于特定用途外，鸡胚成纤维细胞、鸭蛋和鸡蛋通常用于病毒分离和维持。

TMUV还能在广泛的非禽类细胞中复制，用于研究TMUV对哺乳动物宿主的影响。人类细胞系被用来评估病毒的趋向性，并确定TMUV感染的分子机制。HEK293T细胞系和小鼠原代细胞系（MEF）用于研究先天性免疫反应及TMUV的免疫逃避反应。最近使用各种人类细胞系对TMUV细胞取向性进行研究，肝、肾和神经细胞系在不同程度上存在易感性，而肺、肌肉、B细胞、T细胞和单核细胞对感染有很大抵抗力。所有研究表明，TMUV能在广泛的脊椎动物细胞中复制，哺乳动物和鸟类的靶器官相似。但关于人类细胞发病机制的研究还不多，还需要进一步探索。此外，虽然TMUV通过蚊媒叮咬传播，但还需要更多蚊媒生物学信息，并对C6/36细胞进行体外研究。

六、治疗

与其他一些黄病毒感染一样，TMUV没有特定的治疗方法。目前正在评估不同分子的抗病毒效果。如四环素类在体外对嗜神经病毒感染的神经细胞死亡有一定效果。在感染TMUV的鸭神经细胞中也发现了这种神经保护作用。EGCG是一种多酚类活性分子，已经显示出对不同病毒的广谱活性，并且似乎是一种很有希望治疗TMUV感染的药物。在BHK-21细胞中使用EGCG，结果显示TMUV复制显著减少，可能是由于I型干扰素产量增加。经EGCG处理的TMUV感染雏鸭的存活率增加证实了这种效果。新的治疗策略正在研究并用于预防或治疗TMUV。衣壳靶向病毒灭活（CTVI）方法是一种针对衣壳蛋白的抗病毒策略，最初开发用于靶向逆转录病毒，并在DENV和JEV的治疗中取得了成功，最近也被研究用于TMUV的治疗。

七、结语

与其虫媒病毒一样，TMUV利用近年来有利的条件，在亚洲各地传播。2010年，中国首次暴发这种病毒，导致人们重新考虑这种病毒的危险性。其传播在很大程度上是由养殖场密集饲养家禽造成的。在这种情况下，TMUV甚至在没有蚊子媒介干预的情况下在动物之间传播。最后，鸟类的影响尚未得到明确证明，但TMUV在亚洲传播中发挥重要作用。因此，密集的养殖业、日益增长的贸易和环境变化促进了TMUV的广泛传播。这种情况更令人担忧，因为这种病毒有传播到人类的风险。因此，可能会导致一种新的人畜共患病。由于缺乏广泛的监测，迄今为止，该病毒只在3个亚洲国家被检测到，并且只在中国和泰国进行积极研究。但这些国家和病毒的系统发育模式表明，该病毒在亚洲和太平洋地区广泛存在。近年来，关于宿主-病原体相互作用的研究主要集中在禽类模型上，但也应更好地了解哺乳动物，尤其是该病毒的生物学特性及对人的影响。