哺乳动物配子冷冻保存并应用于珍稀濒危动物保护的技术策略

高 峰，何琪富，吴盛辉，王少文，徐雪瑞，康 健，张 涌 *， 权富生*

(1. 西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100； 2. 农业农村部动物生物技术重点实验室，杨凌 712100；3.陕西省动物胚胎工程技术研究中心，杨凌 712100)

动物配子(精子和卵子)冷冻保存在畜牧业生产以及人类辅助生殖方面有较广泛的应用，同时被应用于动物种质资源保护和利用。配子冷冻保存是在超低温情况下，使细胞内的生物活性物质失去活力，并处于休眠状态，新陈代谢、细胞分裂等细胞生命活动暂时停止，但是经过解冻并恢复至正常生理温度时，配子仍具有活性并可实施生物学功能。许多国家应用配子冷冻保存技术建立了遗传种质资源库，即“精子库”“卵子库”等，用于不同种类动物种质遗传资源的保存和利用。通过保存青年濒危动物的配子，维持其生殖潜力，避免了动物衰老或疾病引起的生育力下降或繁殖丧失等问题，在挽救动物濒临灭绝和恢复动物种群中发挥作用。目前，随着生物技术的迅速发展，利用配子冷冻技术有目的性地保存和改良动物基因，能有效维持生物多样性，并提高动物的性状与品质、预防疾病传播、增加辅助生殖技术的可行性和可操作性以及保护珍稀濒危动物等，从而解决人类的健康、生活水平和环境等问题。所以进行动物配子冷冻保存及利用研究，对有效实施动物种质资源保存具有重要意义。

1 国内外对精子冷冻保存和利用研究

精子冷冻是畜牧生产和动物种质资源保存利用的重要方法和手段，随着冷冻生物学技术和理论的进步，精子冷冻技术不断得到提升，精子的冷冻效率和冷冻-解冻后活力也不断提高，并为种质资源保存利用提供了有力保障。

1.1 精子冷冻保存的方法及剂型

精液的冷冻方法一般包括慢速冷冻和快速冷冻。慢速冷冻将精液样品在一定的速率下从室温冷却至-80 ℃，最后放入液氮中保存，整个过程耗时2～4 h。因该技术使精子细胞的外部形成冰晶，所以对精子内部结构和功能的损伤较轻。但是冷冻速度太慢，随着细胞外溶液浓度变大，细胞内水分不断渗透外泄，使精子细胞膜发生皱缩，造成化学性和物理性损伤。快速冷冻是将精子在液氮上方2 cm处熏蒸4～5 min后，置于液氮中保存，该方法能迅速制冷，操作简单，但是冻存过程中降温的速度不可人为控制。于是便开发了程序冷冻法，该方法是通过仪器控制喷出液氮蒸气量来改变精子冻存过程中降温的速率，还能监测温度的变化，已经在牛冷冻精液生产中广泛应用。

精液冷冻剂型常见的有颗粒冻精、细管冻精。颗粒冻精是利用干冰或液氮蒸汽将精液冻成颗粒状，随后置于液氮中长期保存。细管冻精技术是利用直径小、管壁薄的无毒塑料管(0.25 mL或0.5 mL细管)装进精液，然后通过液氮熏蒸法冷冻而成。与颗粒冻精相比，细管冻精避免了精液与液氮直接接触，从而减少污染，并具有密闭无菌、体积固定、受冻均匀等优点，大大降低疾病传播的风险。研究表明，细管冻精技术在解冻后精子活力好，受胎率远高于颗粒冻精。

冻干精子是近几年新研究的冻精技术，利用真空冷冻干燥，使精子保持失水干燥状态，并且在室温或低温环境均能保存。有研究表明，小鼠冻干精子在4 ℃和25 ℃中保存3个月后，对其受精后胚胎的发育能力没有影响。冻干精子具有抗破坏性、储存所需空间小等优点，有效解决了运输和保存等问题，但是该技术仍处于试验阶段，对减轻精子膜损伤的研究尚未成熟，在畜禽冻精中的应用还有待进一步研究完善。

1.2 冷冻-解冻后对精子质量的影响及补救措施

冷冻精子解冻后将温度保持在37 ℃左右，通过镜检判断精子是否符合质量要求，最后再进行利用。目前在人类辅助生殖(ART)方面，人工授精(AI)或者体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术应用最普遍。精子冷冻-解冻过程中，其所处的外界环境会发生一系列剧烈变化，冷冻过程导致质膜和线粒体膜受损，还会引起精子细胞中蛋白质变性、细胞器结构损伤和胞内结晶，而精子细胞器和膜结构完整性是完成新陈代谢所必需的。因此，与新鲜精子相比，冷冻-解冻后精子质量和活力均显著降低，并导致人工授精后受孕率和产仔量降低。通过改变精子冷冻保存条件对其存活率和功能状态有明显改善，为了补救冷冻过程对精子的损伤，添加抗氧化剂、甘油和非渗透性冷冻保护剂均能显著提高解冻后哺乳动物精子的质量。据报道，在解冻溶液中添加钙螯合剂(EDTA和EGTA)，不仅保障胆固醇从精子膜流出，还能使钙流入精子，有效降低冷冻保存造成的损伤，此外，将精浆添加到解冻稀释剂中能提高精子解冻后质量和人工授精后的受孕率。

1.3 精原干细胞冷冻的意义及研究进展

精原干细胞(SSCs)是一种重要的生殖干细胞，通过体外分离培养SSCs，能定向诱导分化成精子，也能将SSCs进行睾丸移植恢复不育雄性动物生精能力，解决哺乳动物的生殖障碍问题。冷冻保存SSCs是保留哺乳动物种质资源的基本材料，也是维持哺乳动物多样性的重要资源。目前，冷冻保存SSCs已成为哺乳动物辅助生殖的必要手段，不仅能充分保留哺乳动物的遗传物质，还能有效保护濒危野生动物和改良家畜品种。与精子冷冻保存相比，SSCs冷冻保存技术起步较晚，在哺乳动物方面的应用不够成熟。SSCs冷冻过程中会发生氧化损伤，产生大量的ROS破坏细胞结构，因此添加抗氧化剂对SSCs的冷冻保存有保护作用。通过改良冷冻-解冻速率和筛选适宜的胞内外渗透条件等，能显著提高SSCs冷冻-解冻后的存活率，并维持胞内结构和功能完整。小鼠SSCs在冷冻-解冻技术以及自我更新和分化机制方面的研究已经比较清楚，在大型哺乳动物上的应用也逐渐兴起，但如何将SSCs理论广泛应用于珍稀濒危动物有待研究，例如：如何优化SSCs冷冻-解冻技术、如何采用高效成熟的方法体外培养SSCs并诱导分化成可利用的精子？SSCs复原后对珍稀濒危动物种质资源保护的效果如何，还需要不断完善和系统评估。

1.4 冷冻保存对精子损伤的评估研究

冷冻过程中精子膜结构和胞内代谢的变化会造成冷冻损伤，主要包括机械性损伤和氧化损伤。国内外对精子冷冻损伤的研究包括精子活力、形态变化以及功能等方面，冷冻-解冻后精子活力下降能直观地评估精子质量和受精率。精子形态变化是由于精子头部、颈部、尾部、质膜、顶体以及线粒体等结构在冷冻后受损引起的。目前，通过流式细胞术、免疫荧光等试验手段能检测精子形态结构的变化，并作为评估精子质量的重要标准。精子功能受损主要包括精子获能和遗传物质的变化，其中，精子获能是完成受精过程的先决条件，冷冻会造成部分精子异常获能现象，从而降低冻精的受精能力。DNA是精子中重要的遗传物质，冷冻导致DNA和染色质完整性受损，对精子的表观遗传修饰产生不利影响，所以说研究精子功能也是评估精子冷冻损伤的关键。

精子在冷冻-解冻过程中脂质过氧化增加，使精子的完整结构受损，造成精子质量下降，从而降低体外受精效率。在正常的机体状态下，活性氧在维持精子的正常功能方面发挥重要的作用，当活性氧的产生和降解失衡时，会引起精子氧化应激增加，使精子胞内的超微结构发生不可逆损伤，甚至导致精子死亡。冷冻保存对精子形态及功能的损伤如图1所示。

关于精子冷冻损伤对精子表观遗传修饰以及后代的影响目前已成为一个新的研究热点，通过表观遗传修饰剂以及小分子的应用，减轻冷冻对精子表观遗传修饰的影响，使冷冻精子的质量和安全性得到显著提高。

2 国内外对卵子冷冻保存和利用研究

卵子的冷冻为家畜等动物种质资源保存提供了卵子库，有利于优质畜禽和珍稀濒危物种的种质资源的长期保存。目前,对卵母细胞冷冻重点侧重于玻璃化冷冻，因为卵母细胞结构功能很特殊，并且对冷冻损伤和冷冻剂毒性非常敏感，慢速冷冻对卵母细胞造成的损伤比较大，导致受精率低。玻璃化冷冻卵母细胞，操作方法简单、快捷，并且受精率和妊娠率与新鲜的卵母细胞相似，成为了最有效、最实用的卵母细胞冷冻保存方法。Zhang等分别利用玻璃化冷冻和慢速冷冻对人类卵母细胞进行冷冻保存，发现玻璃化冷冻的卵母细胞在存活率、体外成熟率、受精率和早期胚胎发育率等方面均优于慢速冷冻。

2.1 卵子获取技术

胚胎试验最常用的卵子采集技术是屠体卵巢采集卵母细胞。在屠宰场收集的动物卵巢运回实验室，通过抽吸法、切割法和剥离法3种方法收集卵巢中的卵母细胞。但是作为珍稀濒危动物或者家畜，除非濒临死亡个体，一般采用活体采卵技术收集卵母细胞，尽量减少对珍稀濒危动物的影响。有报道，利用激素对羔羊进行超数排卵，通过手术，用注射器进行抽吸回收卵子，回收率较高。另外利用卵泡波理论，根据珍稀濒危动物的生理特点在性成熟前、妊娠期等非繁殖期收集卵子，进行体外卵母细胞成熟和体外受精以及胚胎体外生产，从而获得更多可利用的胚胎用于保存或者移植。对于珍稀濒危动物采集卵母细胞的方法和技术还需要不断优化，在尽量减少动物损伤的前提下，提高采卵效率和可利用卵的数量对珍稀濒危动物的卵子保存非常关键。

图1 冷冻保存对精子形态及功能的损伤[38]Fig.1 The damages of cryopreservation to sperm morphology and function[38]

2.2 不同成熟阶段卵子玻璃化冷冻保存的差异

研究表明，卵母细胞玻璃化冷冻可显著降低卵母细胞体外受精后胚胎发育的质量和数量。然而，对不同成熟阶段卵母细胞玻璃化冷冻的研究存在争议。Mara等认为卵母细胞在成熟期(MⅡ)阶段比处于生发泡(GV)阶段的玻璃化冷冻存活率高，而Moawad等认为玻璃化冷冻卵母细胞在GV期或生发泡破裂期(GVBD)比成熟期更有利。

在玻璃化冷冻过程中，GV期的卵母细胞缺少对冷冻损伤敏感的纺锤体，而外周的颗粒细胞导致抗冻保护剂难以渗透进入卵母细胞，使卵母细胞内仍存在大量的自由水，进而引起胞内形成更多的冰晶，最终造成卵母细胞死亡。然而，MⅡ期是在卵母细胞成熟分裂中期，具有独特的中期纺锤体结构并且染色体在赤道板上规则地排列，玻璃化冷冻会引起纺锤体等细胞结构损伤。解冻复原过程中，由于冷冻过程会造成超微结构损伤，导致不同阶段的卵母细胞后续成熟过程中所需的形态学和蛋白质合成难以完成。但是目前大家普遍采用MⅡ期卵母细胞冷冻，在解冻复原后发育、体外受精以及胚胎生产方面具有一定的优势，也取得了比较满意的移植妊娠率，在种质资源保存中应优先采用。同时GV期卵母细胞的冷冻保存以及利用还需要不断研究和改善，有可能最终取代MⅡ期卵母细胞的保存。目前，如何降低不同成熟阶段的卵母细胞对玻璃化冷冻的敏感程度，成为了国内外卵母细胞冷冻保存的研究热点，还需要不断研究和探索。

2.3 玻璃化冷冻保存对卵母细胞损伤的评估研究

迄今为止，卵母细胞冷冻保存研究取得了一系列重要进展，但是冷冻-解冻过程对卵母细胞的超微结构和质量影响还未能有效解决。国内外对玻璃化冷冻引起卵母细胞损伤的评估包括发育能力、形态、超微结构、DNA损伤以及表观遗传修饰等方面，解冻后的卵母细胞经孤雌激活或体外受精，统计卵裂率判定其后续发育能力，利用倒置显微镜直观观察到冷冻-解冻过程引起的卵母细胞形态变化。

卵母细胞在正常情况下超微结构呈现出完整均匀的分布，而经过冷冻-解冻后会出现破损并且分布不均现象。玻璃化冷冻引起卵母细胞中线粒体、皮质颗粒、透明带、细胞膜、细胞骨架和微绒毛等其他超微结构的损伤，而这些超微结构对卵母细胞体外成熟和体外受精具有重要的功能(图2)，目前，常采用透射电子显微镜采集图像评估卵母细胞超微结构损伤程度。卵母细胞冷冻保存时，要面临恶劣的超低温环境和冷冻保护剂的毒性作用，引起卵母细胞核内DNA和染色质受损，导致DNA片段化，彗星电泳实验是检测DNA损伤的重要技术，卵母细胞经裂解液处理，其细胞膜和核膜等膜结构被破坏，使胞内小分子物质扩散至电解液中，核DNA因分子量较大难以进入凝胶内，而断裂的DNA能进入凝胶中并向阳极迁移，因此，DNA受损越严重向阳极迁移的DNA碎片越多，形成的“彗星拖尾”现象越明显。

图2 玻璃化冷冻对卵母细胞超微结构及功能的影响Fig.2 The effects of vitrification on the ultrastructure and function of oocytes

近年来，本课题组进行了玻璃化冷冻对卵母细胞表观遗传修饰的影响及调控研究，发现冷冻卵母细胞解冻复苏后，总体基因组甲基化水平下降，其受精卵早期胚胎的印记基因也发生变化，影响了后续胚胎的发育和妊娠率，也存在发育异常的风险。

3 配子冷冻在珍稀濒危动物保种中的应用策略

目前，人为或者自然因素导致珍稀濒危动物灭绝已经成为一个严峻的全球性问题，为了保护这些物种，需要对珍稀濒危物种的地理分布、栖息环境、生物和生态习性、遗传资源和种群自身生存能力等进行系统研究，并制定科学有效的保种、扩群方案，来拯救这些物种。迄今为止，配子冷冻技术是保护珍稀濒危物种的重要方法之一，并进行了多方面的研究(图3)，为动物种质资源的保护保存提供技术支撑和保障。但是，仍然存在许多问题需要逐步解决，如何优化配子冷冻技术和利用技术，并合理应用于珍稀濒危动物扩群和保护，使配子冷冻对濒危动物的保护贡献率不断提高，需要技术的不断进步和人们不懈地努力。

3.1 珍稀濒危动物精子冷冻保存和利用策略

为了提高珍稀濒危动物精液冷冻保存和解冻复苏后的质量，在稀释液中添加冷冻保护剂，不仅能降低精子内外液体的冰点，还能透过细胞膜与细胞质中生物成分相互作用以及在精子外周形成保护层。优化冷冻方法，摸索最佳冷冻速率，将程序化冷冻技术应用于珍稀濒危动物精子保存中。在精液冷冻和解冻复苏过程中补充抗氧化剂，以保护精子。研究表明，精液冷冻保存时，在冷冻稀释液中添加褪黑素可以显著降低精液中的ROS含量，并减轻精子的冷冻损伤。在珍稀濒危动物中获取精子的难度较大，所以对精子冻存和利用的要求严格，改进冷冻技术对提高冷冻-解冻复苏后精子的存活率和受精率非常重要。当然，对于极度珍稀的精子应采用腹腔镜输精或者卵母细胞单精子注射技术(ICSI)，以减少精子使用量完成人工授精或者卵母细胞体外受精。

图3 配子冷冻技术在保护珍稀濒危物种的应用(以优良种质的牛为例)Fig.3 Application of gamete freezing technology in the protection of rare and endangered species (Take cattle with excellent germplasm as an example)

3.2 珍稀濒危动物卵子冷冻保存和利用策略

为了提高珍稀濒危动物卵母细胞玻璃化冷冻和解冻复原的质量，在玻璃化冷冻前可用生物活性物质预处理卵母细胞。研究表明，利用甘氨酸、含胆固醇的β甲基环糊精和抗冻蛋白预处理可以减轻玻璃化冷冻的GV期卵母细胞细胞膜损伤，提高其成熟率以及随后的胚胎质量和发育潜能。高渗性玻璃化冷冻保护剂对细胞毒性较大，所以要减少处理时间，相反，若处理时间过短，就无法使卵子内的水分被置换，冷冻时就会形成冰晶。因此，要控制好冷冻保护剂处理卵母细胞的时间；活体采集年轻珍稀濒危动物卵母细胞用于玻璃化冷冻，随着母体年龄的增加，冷冻的成功率就越低；选择冷冻速率高、携带冷冻保护剂少的冷冻载体，比如：封闭式拉长细管(CPS)、冷冻环(cryoloop)等冷冻载体。

迄今为止，本课题组在提高卵母细胞玻璃化冷冻效率方面取得了重要研究进展，通过在冷冻液中添加白藜芦醇、Vc等物质，使卵母细胞和胚胎的表观遗传修饰得到改善，提高了胚胎发育率和后代出生率，将这些最新的研究成果应用于珍稀濒危动物卵子和胚胎的冷冻保存将会发挥积极的作用。

3.3 配子冷冻在濒危珍稀动物活体保种中的应用策略

动物种质资源的保护和保存利用，是一项利国利民的系统工程，也是一项长期任务。需要从行政-业务部门-基层进行通力合作，摸清家底，了解珍稀濒危动物的种类和数量。将配子冷冻保存和活体保种同步进行，同时注重动物种质资源的开发利用，尤其对具有地方特色的珍稀濒危畜禽品种，进行资源功能挖掘，通过开发、扩繁和利用的手段，缓解活体保种的压力，使珍稀濒危动物种质资源在利用中得到有效保护。

动物种质资源保护和濒危动物的拯救，需要多学科的合作，将基础应用研究和实际生产、保种过程相联系，图4展示了珍稀濒危动物的保种和扩群技术策略。生物信息学对收集、管理和分析珍稀濒危物种的大型数据集具有重要作用，通过系统生物学研究珍稀濒危物种的复杂机制，以促进其繁殖和扩群。利用与珍稀濒危物种相关的实验模型去探索，验证成功的条件下立即运用于珍稀濒危物种，来更好地完成其扩群和保种。

图4 珍稀濒危动物扩群工作的研究方法Fig.4 Research methods of expansion of rare and endangered animals

在活体保种成本高、难度大的情况下，精子、卵子、胚胎以及体细胞冷冻保存是重要的种质资源保存策略，对其不断进行研发和创新，具有非常重要的意义。通过吸收和借鉴国内外相关冷冻生物学的最新研究成果，进行冷冻技术、冷冻工艺等方面的突破，加强技术创新和集成，使冷冻配子、胚胎等遗传物质的质量和解冻后活力有保障，并应用于挽救和复原已经灭绝或濒临灭绝的动物种质资源保护中，造福于子孙后代。

在动物种质资源保护过程中，根据珍稀濒危动物的等级、种类和配子的易获性等，确定相应的配子冷冻保存和利用策略。同时将冷冻保存与国家、地方种质资源库建设相结合，通过联动协同，进行科研和收集保存胚胎、配子以及体细胞等遗传资源，深度开发利用并向全社会开放，实现动物种质资源和信息的共享。设立相关开放课题，提倡全国性或者国际性的合作，使保存的种质资源得到充分利用。

建立完善的动物种质资源库，从不同地域尺度布局活体动物保护，并对胚胎、配子以及体细胞等遗传物质进行保存和更新利用。建立从保护区、保种场、资源库的多级、多样化种质资源保护、保存机制，应保尽保，使我国的动物种质资源得到充分保护和有效利用，以保证种质资源不丢失、不退化和永续利用。

根据活体保种的情况，结合胚胎、配子等遗传资源的利用，补充活体保种的群体家系数量，减缓活体保种群近交系数的上升。同时通过种质资源库保存的遗传物质复原利用，对建立的保种系统进行科学评价和修正，使活体保种和种质资源库保存有机结合，按照应保尽保的原则，多层面、多维度实现我国种质资源的有效保护和利用。

同时注重种质资源库的更新利用，定期对冷冻保存的精子、卵子等遗传物质的完整性、超微结构以及活力进行全面检测和评价，并补充新的冷冻精子和卵子等，以保证珍稀濒危动物种质库的长期安全保存，为我国动物种质资源现在和未来的开发利用提供保障。