一起犊牛腹泻病的病原学诊断

沈思思

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

犊牛腹泻是犊牛常见疾病，也是养牛业经济损失的主要原因。引起犊牛腹泻因素主要包含病毒和细菌，常见病毒主要包括：冠状病毒(BCoV)、轮状病毒(RV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等，常见细菌主要包括：大肠杆菌(ETEC)和沙门氏菌(Salmonella)等。这些病原体的临床症状和病理剖检相似，确诊需结合实验室检测。本试验旨在采用PCR方法对犊牛腹泻样本进行检测，了解我市某牛场犊牛腹泻的病因，从而进一步控制疾病的发生，为研究犊牛腹泻奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集

无菌采集1月龄发病犊牛肛拭子样本18份。

1.2 主要仪器与试剂

DNA、RNA试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；cDNA反转录试剂盒、DNA MarkerⅡ、Taq酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；离心机（TGL-16G）购自上海安亭科学仪器厂产品；PCR仪（S1000）购自美国伯乐公司产品；凝胶成像仪（WD-9413B）购自北京六一仪器厂产品。

1.3 引物信息与参考毒株

RV、BCoV、BVDV、沙门氏菌和大肠杆菌引物信息见表1。RV阳性样本、BCoV阳性样本、BVDV阳性样本和沙门氏菌分离株、大肠杆菌分离株均由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院实验室保存。

表1 引物信息

1.4 方法

1.4.1 病料处理与核酸提取

将18份肛拭子样本用PBS缓冲液稀释均匀，12000r/min离心5min，取上清液。按照RNA和DNA试剂盒说明书提取RNA和DNA，-20℃保存。将RNA用反转录试剂盒反转录成cDNA，-20℃保存。

1.4.2 PCR扩增

用轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、沙门氏菌和大肠杆菌引物分别对18份肛拭子样本的cDNA和DNA模板进行PCR扩增。反应体系为25μL：cDNA 2.0μL，2×Taq PCR Master Mix12.5μL，上、下游引物1.0μL，ddH2O补足至25μL。PCR扩增条件：95℃5min,95℃30,52℃45s，72℃45s，循环30次，72℃10min。取扩增产物5μL在1%琼脂糖凝胶板上点样，电泳15min，凝胶成像仪上观察结果。送生物工程（上海）股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

PCR结果见图1～图2，分别扩增出RV 231bp和ETEC 498bp的两条条带。测序结果显示，RV与Bank登录序列同源性为100%，大肠杆菌K99同源性为98%。

图1 RV PCR扩增图

2.2 阳性检出率与混合感染情况

18份样本中检测出RV阳性样本5份，阳性率为27.7%；大肠杆菌K99阳性样本9份，阳性率为50%。混合感染率为100%。

3 结论

我们采集了该牛场18份腹泻肛拭子，提取DNA和RNA，并对犊牛常见腹泻病因轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、沙门氏菌和产肠毒素大肠杆菌（ETEC）进行PCR检测，结果表明该牛场腹泻病主要由轮状病毒和致病性大肠杆菌K99混合感染所致，并且混合感染率为100%。

4 讨论

轮状病毒具有高度传染性，对消毒剂有对抗性。50%～100%的牛表现出对RVA的免疫反应。1～3周的犊牛最易感，感染率随年龄的增加而下降。新生犊牛可被母牛排出的病毒感染，感染犊牛从第二天开始通过粪便排出病毒，这种排出可持续7～8天。RV通常影响新生犊牛，3个月以上的犊牛通常不受影响。感染犊牛通常会导致严重腹泻甚至危机生命。

RV的发病机制和严重程度通常受初乳摄入量、犊牛的日龄、健康状况、母牛的免疫状态和病毒的毒力影响。母牛在分娩前接受两次疫苗接种刺激特异性抗体产生，犊牛在出生后6小时内接受2～3升的初乳，通过初乳产生被动免疫来抵抗疾病的发生。