多肽复配组合物对皮肤结构相关效应蛋白促进表达协同增效的研究

皮肤中存在众多的ECM（extracellular matrix，细胞外基质）蛋白，其中胶原蛋白、弹性蛋白是最重要的两种

，它们在皮肤抗衰老中起着非常重要的作用。除了胶原蛋白和弹性蛋白，还有非常多的结构蛋白，结构辅助蛋白

。在这些结构辅助蛋白里，LOXL-1是一种很重要的细胞外依赖铜的胺氧化酶

，催化胶原蛋白和弹性蛋白中交叉链接形成的第一步，其表达量的增加能更好地促进胶原蛋白和弹性蛋白纤维的生成

。

弹性蛋白是弹性纤维(elastic fbers)的主要成分。弹性纤维主要存在于韧带和脉管壁。弹性纤维与胶原纤维共同存在， 赋予组织以弹性和抗张能力。尽管弹性蛋白只占真皮总蛋白的2%，但它对皮肤弹性起着重要作用

。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物都是各大化妆品公司经常使用的核心原料，原料供应商提供的之前的研究资料表明，乙酰基二肽-1鲸蜡酯能有效促进弹力蛋白的再生，注重弹性纤维的修复，为肌肤打造一层健康、紧致的纤维网络，抑制表情纹。它同时被称作肌肤的“弹力素”，可支撑松垮的皮肤，提供紧致上扬的弹力。乙酰基四肽-2可以上调与胶原蛋白合成和黏着斑有关的基因表达，诱导弹性蛋白、I型胶原蛋白合成，从而增加皮肤紧实度。假交替单胞菌发酵产物提取物具有促进成纤维细胞增殖，诱导I型，IV型胶原蛋白和弹性蛋白合成，提高皮肤屏障功能，减少炎性基因表达，抑制脂质过氧化等诸多功效，然而对这三者进行的单独和联合的功效比较测试还未有研究，此次研究就评估了三个原料的联合对皮肤相关结构蛋白的协同增效促进作用。

材料和方法

01 试剂与仪器

DMEM 培养基（20210121/20210406，Cellmax），血清（2132094P，Gibco），胰酶（20210113/20210323，碧云天），双抗（20200828，北京索莱宝科技有限公司），TRIzon（03877/35120，康为世纪），三氯甲烷（20200105，国药化学试剂），HiFiScript cDNA Synthesis Kit（100rxns34520，康为世纪），UltraSYBR（31420，康为世纪）, 噻唑蓝（MTT，Sigma-Aldrich 公司， M2128-100MG），HFF-1人皮肤成纤维样细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库, 培养条件：5% CO

，37℃恒温培养箱,培养基：89% DMEM+10%FBS+1%双抗）， 乙酰基二肽-1鲸蜡酯（1453629，Sederma），乙酰基四肽-2 （U19B013-20，Lipotec），假交替单胞菌发酵产物提取物（U07K010-19，Lipotec），生物显微镜（LWD300-38LT，上海测维光电技术有限公司），恒温水浴锅（HH-1嘉兴俊思电子有限公司），高速冷冻离心机（Sorvall Legend Micro 17R，Thermo），CO

培养箱（BB150，Thermo），纯水仪（Smart-DUF，上海和泰仪器有限公司），多功能酶标仪（SpectraMax iD3，Molecular Devices）。

02 测试方法

取指数生长期的细胞制成单细胞悬液，以1×104 cells/mL的密度接种于96孔板上，用含10%胎牛血清的培养基37℃培养24 h使细胞贴壁，培养终体积为0.2mL，而后吸弃上清，加入新鲜制备的不同浓度的药物（无血清）或者不加药物（无血清）孵育，培养终体积为0.2 mL。24 h后，显微镜下观察细胞毒性情况。MTT法检测细胞毒性，于490 nm测定吸光度，计算细胞活率。细胞活率 =A

/A

×100%。

取指数生长期的细胞制成单细胞悬液，以1×105 cells/mL的密度接种于6孔板上，用含10%胎牛血清的培养基37℃培养24 h使细胞贴壁，培养终体积为2 mL。而后吸弃上清，加入新鲜制备的不同浓度的药物（无血清）或者不加药物（无血清）孵育，培养终体积为2 mL。24 h后，按RNA提取标准操作流程提取各孔RNA，qPCR法检 测HFF-1细 胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1 、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1 、TGF-β、Integrin mRNA的表达影响。

行动主张：建议学院专业再次结合现专业、行业背景确定什么是基本能力，什么是必要的扩展能力，当下行业紧俏的扩展能力，但不能设置的太高，不然达不到技训的目的。

本研究选取5 μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合对HFF-1细胞孵育24 h，提取细胞总RNA后，qPCR检测胶原蛋白相关mRNA的表达，结果如图2所示。5 μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独给药能促进COL-I， COL-III，COL-IV, LOXL-1的表达，与单独给药相比，5 μg/mL 乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物联合给药，协同增加HFF-1细胞Col-I、LOXL-1mRNA的表达（

＜0.05）。

受试物和对照品用DMSO或者ddH2O配制成母液，再用无血清培养基或者PBS稀释至合适浓度。

本题是培养学生转化能力的极佳素材，虽然条件一读就懂、图形一看就明，但一做却又难以入手．不过，借助“知识溯源式目标分析法”却可巧妙地让解题思维转化路线图水落石出．

分别用0.1、0.5、1、5、10、20、40 μg/mL 乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物，或乙酰基二肽-1鲸蜡酯：乙酰基四肽-2：假交替单胞菌发酵产物提取物质量比为1：1：1联合给药，MTT法评估细胞毒性，结果如图1所示，由图1可知，乙酰基二肽-1鲸蜡酯在20ug/mL下都没有细胞毒性，乙酰基四肽-2在40ug/mL都没有毒性，假交替单胞菌发酵产物提取物在40ug/mL下都没有细胞毒性，乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物三者1：1：1联合给药，在20ug/mL下非但没有细胞毒性，而且还能促进细胞增殖。

虚拟云桌面就是对计算机桌面进行虚拟化，它是通过在数据中心服务器上创建虚拟桌面为载体，然后运用一系列网络传输协议将远端的操作系统和应用发送给多媒体教室终端设备的过程。南京城市职业学院多媒体教学场景所采用的虚拟桌面是通过VMware vSphere构建虚拟化平台+瘦客户机的方式实现的。通过虚拟化技术的运用，使整个部署过程变得十分简便，也让远程统一管控变为现实。

结果

01 受试物对HFF-1细胞毒性的影响

细胞给药后提取总RNA，qPCR，检测HFF-1细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表达影响。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯， 乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合给药24 h对HFF-1细胞增殖的影响。

= 3, Mean ± SEM。“ ＊＊＊ ”表示与对照组相比

＜ 0.001。

02 受试物对HFF-1细胞胶原蛋白相关基因表达的影响

近几天来，杨力生做生意特别赚钱，他心里高兴，想起了老婆一些好处，便想和老婆亲热一番。晚上九点以后，孩子到西间睡去了。杨力生凑到老婆身边，讨好地说：“怎么样，今天很累吗？”

采用Excel录入和 GraphPad Prism 7 软件包统计处理，以均数±标准误表示。各组间做单因素方差分析（ANOVA）。认为

＜0.05有统计学差异。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2、假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合给药24 h对HFF-1细胞胶原蛋白相关基因mRNA表达的影响。

= 3, Mean ± SEM。“＊”表示与联合给药组相比

＜ 0.05， “ ＊＊ ”表示与联合给药组相比

＜ 0.01， “ ＊＊＊ ”表示与联合给药组相比

＜ 0.001。

给予康复训练，首先是采用冷刺激阀，刺激患者的口腔、咽喉部，如采用冷冻棉签按摩口唇、咽颊部与咽腭弓，帮助患者练习吞咽动作，提高其舌体的力量及灵活度等；其次帮助患者进行屏气、发声运动，指导其在坐椅上，并用双手支撑、推压，同时做屏气动作，注意应保持胸廓的固定，声门也应紧闭，再突然松手、开声门、呼发声；最后训练其自行摄食，应选择30～60°颈前屈、仰卧位进食[3] 。以上训练方法时间为30 min，1次/d。训练时间为2周。

03 受试物对HFF-1细胞弹性蛋白相关基因表达的影响

5 μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独或1：1：1联合对HFF-1细胞孵育24 h，提取细胞总RNA后，qPCR检测弹性蛋白相关mRNA的表达，结果如图3所示。5 μg/mL乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL假交替单胞菌发酵产物提取物单独给药能促进Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin 的mRNA表达，与单独给药相比，5 μg/mL 乙酰基二肽-1鲸蜡酯、5 μg/mL乙酰基四肽-2、5 μg/mL 假交替单胞菌发酵产物提取物联合给药协同增加HFF-1细胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA 的表达（

＜0.05）。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯，乙酰基四肽-2，假交替单胞菌发酵产物提取物单独或联合处理24 h对HFF-1细胞相关mRNA表达的影响。

= 3, Mean ± SEM。“＊”表示与联合给药组相比

＜ 0.05，“ ＊＊ ”表示与联合给药组相比

＜ 0.01， “ ＊＊＊ ”表示与联合给药组相比

＜ 0.001。

软土路基处理技术在我国公路工程建设中发挥了重要作用。公路软土路基处理技术发展历史较长，经多年的发展积累了丰富的经验。路基处理技术的发展可分为两个时期，建国初期应用路基处理技术主要为挤密土桩，砂石垫层等。80年代后期，随着改革开放的发展，建筑工程建设不断进步。在公路工程建设中引进了大量的国外先进技术，促进了我国建筑事业建设发展。

小结与讨论

化妆品中的生物多肽类化合物具有高生物活性、易吸收、安全无毒的独特优势。近年来其在美容护肤、抗衰老研究课题中的生理作用与生物效应逐渐引发关注

；多肽的生物学活性取决于其氨基酸组成和序列，人体内各种生理进程几乎都是由特定的氨基酸序列组成的多肽或者蛋白质调控的。因此，生物活性肽为化妆品研发和应用提供了全新方向和思路，并且功能越来越细分，如抗衰老、抗过敏、修复、抗氧化、抗水肿、促进毛发再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妆品中能够帮助改善、修复皮肤的各种问题，但目前单种多肽活性物质应用报道较多，而多种多肽和活性物的组合应用研究开发较少

，特别是多种不同类型的肽类和活性物组合针对抗衰老的靶点协同增效作用报道较少。本研究中的多肽提取物组合协同增效结果，在活性物组合的研究中，具备较强的创新性。在本研究中，我们采用乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2、假交替单胞菌发酵产物提取物联合给药，发现协同给药能协同促进HFF-1细 胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5 mRNA的表达，获得更强、更显著的抗衰老效果。

本罪为情节犯，由法条可以看出，分为情节严重和情节特别严重，相对应的有两种轻重不同的法定刑。至于何谓“情节严重”或“情节特别严重”，并没有明确规定。一般认为，多次、大量非法获取他人计算机数据的为情节严重。

综上所述，本研究采用乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2和假交替单胞菌发酵产物提取物三种活性组份，针对抗衰老的靶点进行协同增效作用，能够显著地增加对抗衰老相关的重要蛋白的表达。因而，本研究中的抗衰老组合物、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基四肽-2、假交替单胞菌发酵产物的联合应用，具有更好的协同增效的抗衰老活性，因为联合作用功效增强了，在同等的功效下，联合作用原料可以用量更小，所以这样的组合具备在化妆品产品中少量添加就能达到更好效果的应用前景。

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