载紫杉醇聚乙二醇修饰的大黄酸偶联物胶束制剂稳定性研究

陆伟利，王夏英，许雪雅，郑雅玲，徐 伟，王晓颖

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是一种天然的二萜类化合物，临床上常用于治疗恶性肿瘤。但由于PTX水溶性极低，这严重限制了PTX的临床使用，国内外研究者分别从化学改构、物理引导、改进制剂技术等不同角度来解决这个问题。近年来，研发具有靶向特异性的PTX新型释药系统成为了国内外广泛关注的热点。

近年来纳米材料在癌症诊断和治疗中得到了广泛应用［1-4］。聚合物胶束（polymeric micelles，PMs）由两亲性聚合物组成，能够在水性环境中自组装成粒径较小的纳米结构［5-7］，具有疏水性内核和亲水性外壳，能提高难溶性药物的水溶性［8-10］。PMs作为纳米级给药系统具有：①提高难溶性药物的溶解度和稳定性；②可生物降解和低毒性；③可延长药物在体内循环时间，增强渗透滞留效应等特性［5，11］。

本课题组前期合成了一种能在水中自组装成聚合物胶束的两亲性聚已二醇（PEG）修饰的羧甲基壳聚糖-大黄酸偶联物（CRmP偶联物）［12］。以CRmP偶联物为载体，紫杉醇（PTX）为模型药物进行物理包载，制备得到载PTX的CRmP胶束（PTX/CRmP胶束）。冻干技术能够将水以固态的形式直接升华去除，具有保持物质活性、防止其被氧化和加水易复原等优势，广泛用于保存蛋白质、血清和细胞等生物物质［13-14］，并且可用于改善纳米载体例如脂质体等的稳定性［15］。然而，冻干过程的极端环境可能会对聚合物纳米胶束的状态造成破坏，因此，需要添加冻干保护剂进行保护。本研究旨在优选PTX/CRmP胶束冻干制剂的最佳冻干保护剂，同时探讨在添加最佳冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂与临床常用输液配伍后以及在高温、高湿及长期贮存的条件下的稳定性，为该制剂的临床安全应用提供依据。

1 实验材料

1.1 试剂与材料 CRmP偶联物（自制）；PTX/CRmP胶束（自制）；紫杉醇（上海中西三维药业有限公司，批号：201801004）；MWCO14000透析袋（上海绿鸟科技发展有限公司）；甲醇（色谱纯）、葡萄糖（分析纯）、蔗糖（分析纯）、甘露醇（分析纯）均购于国药集团化学试剂有限公司；乳糖（分析纯，天津永大化学试剂公司）。

1.2 仪器 JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD plus冷冻干燥机（德国Christ公司）；NICOMPTM 380ZLS激光粒径测定仪（美国Santa Bbarbara公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本株式会社岛津制作所）。

2 方 法

2.1 PTX/CRmP胶束冻干制剂的制备 采用透析法［12］制备的PTX/CRmP胶束溶液分别加入一定量的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖作为冻干保护剂，溶解混合均匀，分别得到含0.1%、0.2%、0.4%的葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖12种冻干保护剂的混合溶液，按1 mL/瓶分装，每种溶液制备3份，-20℃冰箱预冻24 h后，冷冻干燥即得。

2.2 PTX/CRmP胶束最佳冻干保护剂的筛选 冻干后观察冻干制剂的外观；称取一定量的冻干制剂加入超纯水配制成2 mg/mL溶液，每种溶液制备3份，观察其复溶性；以1 mg/mL浓度加入粒径仪中4 mL标准样品池（1 cm×4 cm，石英玻璃），设定测量时间为3 min，即可测得溶液中胶束粒径平均值及溶液体系的多分散系数（PDI）；载药量及包封率的测定及计算方法参见文献［12］。分别以PTX/CRmP胶束冻干制剂的外观、复溶性、粒径、PDI、载药量及包封率为指标，考察12种冻干保护剂对PTX/CRmP胶束冻干制剂的保护效果，并优选出最佳冻干保护剂。

2.3 PTX/CRmP胶束冻干制剂稳定性试验

2.3.1 与常用输液配伍 以0.2%甘露醇作为最佳冻干保护剂，根据“2.1”项下制备PTX/CRmP胶束冻干制剂。取该冻干制剂若干分别采用注射用水、0.9%氯化钠溶液、5%葡萄糖溶液溶解稀释至浓度为2 mg/mL，置于室温（25℃）下24 h，分别于0、4、8、12、24 h取样测定其粒径及PDI。

2.3.2 高温试验 以0.2%甘露醇作为最佳冻干保护剂，根据“2.1”项下制备PTX/CRmP胶束冻干制剂。称取该冻干制剂置于西林瓶中，在60℃条件下放置10 d，分别在第5天和第10天取样，观察样品的外观，加水配制成1 mg/mL溶液后测定其载药量、包封率、粒径、PDI及电位。

2.3.3 高湿试验 以0.2%甘露醇作为最佳冻干保护剂，根据“2.1”项下制备PTX/CRmP胶束冻干制剂。称取该冻干制剂置于西林瓶中，放置于温度为25℃，相对湿度为（90±5）%的试验箱中10 d，分别在第5天和第10天取样，观察样品的外观，计算吸湿增重，加水配制成1 mg/mL溶液后测定其载药量、包封率、粒径、PDI及电位。

2.3.4 长期储存试验 以0.2%甘露醇作为最佳冻干保护剂，根据“2.1”项下制备PTX/CRmP胶束冻干制剂。称取该冻干制剂置于西林瓶中，置于室温25℃下3个月，并分别于第0、1、3个月取样，观察样品的外观，加水配制成1 mg/mL溶液后测定其载药量、包封率、粒径及PDI、电位。

3 结 果

3.1 PTX/CRmP胶束最佳冻干保护剂的筛选 加入不同冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂的外观状态和复溶性比较见表1。结果显示以0.2%甘露醇作为冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂呈黄色棉絮状，表面完整，无塌陷皱缩，质地疏松，用刮刀轻刮不黏附于刮刀上，加入适量溶剂复溶后轻摇即可形成均一黄色透明的溶液。添加不同冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂的载药量、包封率、粒径及PDI比较见表2。结果显示以0.2%甘露醇作为冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂具有较高的载药量和包封率及较小的粒径。因此，选用0.2%甘露醇作为PTX/CRmP胶束冻干制剂的最佳冻干保护剂。

表2 添加不同冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂的载药量、包封率、粒径及PDI比较（±s）

表2 添加不同冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂的载药量、包封率、粒径及PDI比较（±s）

保护剂无保护剂0.1%葡萄糖0.2%葡萄糖0.4%葡萄糖0.1%甘露醇0.2%甘露醇0.4%甘露醇0.1%蔗糖0.2%蔗糖0.4%蔗糖0.1%乳糖0.2%乳糖0.4%乳糖n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3载药量/%38.25±3.38 39.19±2.98 39.57±2.75 40.57±0.87 39.06±1.68 40.19±1.06 39.32±0.60 36.17±0.75 38.96±0.45 36.09±2.24 38.82±3.79 40.50±0.74 38.92±1.19包封率/%70.31±6.21 72.04±5.48 72.74±5.05 74.58±1.60 71.80±3.10 73.87±1.94 72.28±1.10 66.49±1.37 71.62±0.83 66.33±4.12 71.36±6.97 74.45±1.36 71.53±2.19粒径/nm 203.6±4.50 221.6±12.4 209.3±2.8 218.0±10.0 205.4±2.2 197.4±2.0 200.0±3.0 204.8±8.2 202.4±5.2 201.9±0.1 211.1±2.1 209.0±7.3 211.8±4.6 PDI 0.137±0.026 0.162±0.011 0.153±0.054 0.181±0.046 0.120±0.030 0.196±0.034 0.173±0.037 0.165±0.029 0.183±0.040 0.182±0.058 0.124±0.014 0.163±0.039 0.133±0.034

3.2 PTX/CRmP胶束冻干制剂稳定性

3.2.1 与常用输液配伍 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂与注射用水、0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液配伍后24 h内稳定性指标比较见图1。结果表明该冻干制剂用5%葡萄糖注射液配伍后粒径均无明显变化，但用0.9%氯化钠注射液配伍后粒径均减小，且PDI随着时间的延长有减小的趋势，故选用0.9%氯化钠注射液作为最佳配伍溶剂。

图1 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂与常用输液配伍稳定性试验

3.2.2 高温、高湿试验 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂在高温、高湿条件下的稳定性指标比较见表3和表4。结果表明在高温、高湿条件下，该冻干制剂的外观均无明显变化，始终呈黄色饱满絮状，且在第5天和第10天取样测定的载药量、包封率、粒径、PDI、电位等均无明显变化，在高湿条件下吸湿增重低于5%，表明该冻干制剂具有较好的稳定性。

表3 高温条件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂稳定性试验（±s）

表3 高温条件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂稳定性试验（±s）

时间第0天第5天第10天外观黄色饱满絮状黄色饱满絮状黄色饱满絮状载药量/%35.50±1.01 38.64±4.30 32.26±5.28包封率/%63.62±2.97 68.99±6.78 59.27±5.95粒径/nm 205.7±4.4 211.2±23.9 190.8±15.3 PDI 0.119±0.022 0.132±0.014 0.154±0.034电位/mV-27.15±2.2-29.74±1-31.48±0.86

表4 高湿条件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂稳定性试验（±s）

表4 高湿条件下添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂稳定性试验（±s）

时间第0天第5天第10天外观黄色饱满絮状黄色饱满絮状黄色饱满絮状载药量/%36.10±1.25 35.24±6.20 36.92±3.82包封率/%67.12±1.07 65.10±5.18 66.65±4.05粒径/nm 198.2±10.5 201.4±13.7 210.3±21.9 PDI 0.141±0.015 0.127±0.021 0.149±0.029电位/mV-29.36±3.9-30.56±1.7-32.70±0.51

3.2.3 长期储存试验 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂在室温条件下，储存0、1、3个月后稳定性指标比较见表5。结果表明随着储存时间的延长，该冻干制剂复溶后的各项稳定性指标均无明显变化，表明该冻干制剂长期储存稳定性良好。

表5 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂长期储存的稳定性试验（±s）

表5 添加0.2%甘露醇的PTX/CRmP胶束冻干制剂长期储存的稳定性试验（±s）

储存时间0个月1个月3个月外观黄色饱满絮状黄色饱满絮状黄色饱满絮状载药量/%37.07±0.51 36.90±4，21 35.89±2.64包封率/%66.83±2.10 70.31±0.38 68.55±3.20粒径/nm 205.2±0.7 201.3±1.83 198.3±2.64 PDI 0.135±0.020 0.156±0.011 0.121±0.065电位/mV-30.52±1.9-29.66±2.8-30.71±4.5

4 讨 论

冷冻干燥后的胶束有利于储存，但是在冷冻干燥的过程中，常常会改变纳米胶束的状态，如出现聚集等现象。冻干保护剂又称为冻干赋形剂，能使冷冻干燥产物色泽一致，质地良好，具有一定的物理强度和良好的复溶性。研究分别以冻干粉末的外观状态、复溶性以及载药量、包封率等作为评价指标，对4种常用成本较低的保护剂及其浓度进行了筛选。

在冻干保护剂筛选结果中，不加冻干保护剂的PTX/CRmP胶束冻干制剂呈黄色棉絮状，表面完整，无塌陷皱缩，加入水探头超声后溶解，形成均一的溶液。加入冻干保护剂后的冻干制剂表面均没有塌陷，色泽均一。以葡萄糖和蔗糖为冻干保护剂的冻干制剂易吸潮、黏稠，容易黏附到瓶壁上，且二者冻干制剂复溶都相对较困难。以甘露醇和乳糖为冻干保护剂的冻干制剂复溶效果好，然而加乳糖的冻干制剂轻微吸潮，且随着存储时间的延长黏稠度不断增加，不利于储存。综合复溶后的粒径、载药量、包封率等指标，最终确定0.2%甘露醇作为PTX/CRmP胶束的最佳冻干保护剂。

PTX/CRmP胶束冻干制剂与常用输液的配伍稳定性可影响胶束冻干制剂的状态、药效的发挥以及用药安全性。本研究结果显示：PTX/CRmP胶束冻干制剂更适合与0.9%氯化钠注射液配伍使用，在24 h内具有良好的稳定性；且PTX/CRmP胶束冻干制剂储存稳定性良好，在高温、高湿、长期储存条件下，其理化性质稳定，有利于该制剂的运输、储存及临床应用。

（致谢：本项目由闽台中药分子生物技术国家地方联合工程研究中心、福建省中药学重点实验室、福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成并提供帮助。）