鸽子兰花芽分化观察研究

倪子轶

（上海辰山植物园，城市园艺技术研发与推广中心，上海201602）

鸽子兰（Peristeria elataHook.）是兰科，鸽兰属多年生大型落叶草本植物，也是该属的模式种，是巴拿马的国花，受到《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅰ的保护［1］，其花形奇特、花大色纯，叶形飘逸，植株健美，是一种优良的观赏植物。鸽子兰既适用于室内栽培，亦能作为优良的切花材料，极具开发潜力，而且其花期主要在7～10 月，花序开花可持续月余。从商业价值来看，开花的时间限制了鸽子兰作为观花产品的使用，若能将其花期改变至元旦、春节等花卉消费旺季，必能大大提高其商品价值，促进其产业化发展，因此有必要对鸽子兰进行花期调控技术研究。

现阶段，鸽子兰的相关研究主要集中在形状观测、组培快繁［2］等方面。鸽子兰的花芽生长情况、花器官分化进程、成花因子及相关生理变化等方面的研究报道较少，花芽分化规律的研究报导在其他兰科植物领域也非常罕见，现有的报道中指出可使用石蜡切片的方式进行观察研究［3-5］。为明确鸽子兰成花机理，需对其花芽分化进行观察，为后续研究提供参考依据。

1 试验材料

1.1 材料备置

试验材料为假鳞茎直径大于5 cm，具5 年苗龄且大小一致的鸽子兰植株，于上海辰山植物园兰科温室进行常规保育管理。

自2019 年7 月下旬至2019 年8 月下旬止，每隔三天取样一次鸽子兰花芽，每次取花芽块1～2 个，取样后立即置于含福尔马林5 mL、冰醋酸5 mL、70%酒精90 mL 固定液中固定保存其花芽，用于石蜡切片，以确定鸽子兰花芽分化的时期［6-8］。

1.2 材料固定

按试验设定的间隔取样，每次取3 个花芽。在完成取样后，应尽快将样品放在固定液中，需固定24 h 以上。为了加快鸽子兰花芽吸收固定液，排出花芽间隙的空气和固定液中溶解的空气，把材料在真空泵中抽气20～30 min，取出后更换新的固定液，常温或者4℃冰箱保存。材料无法立即处理时，应置于70%酒精长期保存。

2 试验方法

2.1 脱水-透明

将材料置于75%、85%、95%酒精中进行脱水各1 h，100%酒精换两次，每次1 h；取出材料置于体积比为2∶1、1∶1、1∶2 的酒精、二甲苯溶液中各1 h，然后转入纯二甲苯溶液中浸泡1 h。

2.2 浸蜡

浸蜡时，如遇石蜡凝固，通常由于温度太低导致未达到浸蜡效果；如遇材料收缩，则由于温度过高所致，甚至导致无法切片。经脱水-透明后的花芽放入体积比1∶1石蜡、二甲苯中45℃过夜，第二天升温至50℃，4 h后升温至60℃，4 h后将溶液换成纯石蜡液过夜，第三天再次更换纯石蜡液并升温至61℃，4 h 后升温至62℃过夜，第四天可进行包埋处理。

2.3 包埋

将熔化后的石蜡倒入纸盒内，倒入的量为满盒，同时，镊子需通过酒精灯烧热，并立即放入盒内，按需要的切面调整材料的朝向和位置，材料之间留有一定的间隙，便于后续操作。利用包埋机4℃平台降温凝固。

2.4 粘块、修块

粘块：将包埋好的蜡条根据材料位置分割成小块，用刀片稍加修整成正方形，准备木块并放少量蜡液，刀片通过酒精灯加热，用刀片将木块上的蜡液磨平，也便于固定小木块和蜡块。

修块：修块是减少切片褶皱、保证切片质量的关键步骤，需将花芽的位置修整清晰，修去蜡块切面的石蜡。明确花芽位置后将左右两侧的石蜡修平整。通过修整位于组织块的上下边缘石蜡，使切片呈带状且平整。

2.5 切片-黏片

黏片剂需提前制备，过滤后的蛋清液作为溶液甲存放于5℃冰箱保存，溶液乙为无菌水。展片台温度设置为45℃。提前用棉布和酒精擦干净载玻片，在展片台上平放备用。

按照切片的角度，将木块固定在切片机上，通过匀速操作，使得切片呈带状，在载玻片上滴1滴溶液甲，抹匀后再滴1～2 滴溶液乙，使用镊子将切片带平铺在载玻片上。在展片台上平放载玻片，烘干后即可进行下一步操作。

2.6 脱蜡-染色

载玻片置于纯二甲苯Ⅰ（脱蜡1 h）→纯二甲苯Ⅱ（脱蜡1 h）→纯二甲苯Ⅲ（脱蜡1 h）→纯二甲苯Ⅳ（脱蜡1 h）→体积比1∶1 酒精、二甲苯溶液（15 min）→100%酒精（15 min）→95%酒精（15 min）→85%酒精（15 min）→75%酒精（15 min）→1%番红染色（大于4 h 或过夜）→75% 酒精（10 min）→85% 酒精（10 min）→95% 酒 精（10 min）→0.5% 固 绿 染 色（10 s）→100% 酒 精Ⅰ（20 min）→100% 酒 精Ⅱ（20 min）→体积比1∶1 酒精、二甲苯溶液（20 min）→纯二甲苯Ⅴ（20 min）→纯二甲苯Ⅵ（20 min）。

2.7 封片

倾斜拿住载玻片，用滴管取中性树胶1～2 滴于载玻片上，取盖玻片从载玻片底部自下而上覆盖，利用通风橱初步吹干，1天后转入烘箱43℃烘干。

在数码显微照相装置（DP73型号，OLYMPUS 公司）下观察并照相。

3 结果与分析

3.1 花的形态特征

鸽子兰的花序由假球茎的基底部伸出，花梗较高，可达100 cm 以上，花朵可达10 朵。花序为螺旋型无限花序，开花自下而上，单花的花径约4～5 cm，花白色，肉质，杯状，散发出幽香。鸽子兰因其花朵内的唇瓣与蕊柱看似一只停坐的鸽子而得名［9］，每年7～8月为盛花期。

3.2 花器官形态分化过程

观察切片可得，花朵形态可观察到的鸽子兰花器官分化过程大致分为萼片原基分化期、花瓣原基分化期、和蕊柱分化期。

3.2.1 萼片原基分化期

小花原基膨大且宽，顶部凹陷，从边缘分化出的突起为萼片原基，从横切面上可以看到两个突起的萼片原基，且不断伸长发育出两个萼片（图1）。图1中SE为花萼原基。

图1 萼片原基分化期Fig.1 Sepal primordium differentiation phase

3.2.2 花瓣原基分化期

萼片原基内侧的小花原基产生变化，宽而平，顶部内凹，形成“V”字形缺口，舌状凸起是唇瓣原基（图2）。图2中SE为花萼原基，PE为花瓣原基。

图2 花瓣原基分化期Fig.2 Petal primordium differentiation phase

3.2.3 和蕊柱分化期

和蕊柱原基是花瓣原基在持续变长时，和蕊柱原基分化时，内侧分化出的新突起，顶端膨大成椭圆形，并分化形成花粉囊，在和蕊柱基部内出现凹陷，发育为蕊喙，此时，和蕊柱分化期出现（图3，图4）。图3与图4中SE 为花萼原基，PE 为花瓣原基，L为唇瓣，CO为和蕊柱原基。

图3 和蕊柱原基分化期（Ⅰ）Fig.3 Column primordium differentiation phase（Ⅰ）

图4 和蕊柱原基分化期（Ⅱ）Fig.4 Column primordium differentiation phase（Ⅱ）

3.3 讨论

根据石蜡切片结果所示，花序原基分化和花蕾原基分化期在采样时已完成，可见当花序出现时，鸽子兰已完成这两个时期。推测在花芽明显可分辨，即最初采样约2 cm 样本（图5）前，此时可通过剥除外苞片用显微镜辨别花序（图6）。

图5 鸽子兰的花芽Fig.5 Bud of P.elata

图6 鸽子兰的花序Fig.6 Inflorescence of P.elata

鸽子兰在花芽分化之前过渡到生殖生长的这一转化过程中，其顶端分生组织的形态显著变化。随着生殖生长的开始，花序原基逐渐延伸成圆锥形，其过程类似于红球姜花芽的分化［10］。

从切片展现的形态发现，若需观察花序原基分化和花蕾原基分化期前的分化状态，应更早采样，即于肉眼无法分辨叶芽、花芽时采样。在处理花芽材料时，可适当留有苞片，作为休眠期、萌动期、花芽分化前期［11］的参照物。