超声波辅助提取黄精总氨基酸的工艺优化*

韦国兰，白 凤，龙杰凤，胡秀虹，吴汉清

(凯里学院，贵州 凯里 556011)

中药黄精为滇黄精、黄精和多花黄精的干燥根茎，其性平、味甘，入脾、肾、肺经，具有补肾益精、滋阴润燥等功效[1-2]，主治肺燥干咳、心悸气短、体虚乏力、高血压和糖尿病等症，为我国传统药材，属“药食同源”植物[3]。黄精作为药食两用的中药，具有悠久的历史，贵州黔东南苗药材市场黄精资源丰富，很多人喜欢用黄精炖鸡汤、炖猪蹄、煮粥，据说不仅味鲜而且还很大补；可以美容养颜缓解衰老；黄精也被利用开发做成保健食品。

现代研究表明，黄精含有多糖、皂苷、醌类、多酚类和多种对人体有用的氨基酸等成分，具有延缓衰老、降低血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗抑郁、改善记忆功能和防止阿尔茨海默病等作用[4-10]。其中氨基酸是黄精补益强壮作用和增强免疫功能的物质基础之一，对维持生命活动有着非常重要的作用[11]。目前，关于黄精总氨基酸的提取文献报道较少，所以本实验用贵州黔东南州镇远县的黄精作为原料，对黄精总氨基酸的提取进行研究，使用酶标仪测定黄精总氨基酸的含量，来确定黄精总氨基酸的提取最佳条件。本实验为黄精的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄精采自贵州省凯里市镇远县羊场镇，所用试剂为L-酪氨酸、磷酸二氢钾、合水茚三酮、氢氧化钠、无水乙醇等。

FSP120-AAAN2酶标仪(全汉企业股份有限公司)、电子分析天平(奥豪斯国际贸易公司)、80-2离心沉淀器(常州市国立实验设备研究所)、HH-S 数显恒温水浴锅(常州市翔天实验仪器厂)、WGLL-230BE 电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、高速万能粉碎机(北京科伟水兴仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料前处理

准备黄精药材，清洗干净除去其表面的泥土，晒干，取黄精的根茎部位切成薄片放置在70 ℃烘箱中烘干，黄精片变脆后于万能粉碎中粉碎成细粉，过30目药筛，将所得粉末装入自封袋中保存，备实验使用。

1.2.2 溶液的配制

茚三酮溶液的配制：称取茚三酮1.0012 g，加乙醇使其溶解，等全部溶完后，再移到50 mL容量瓶中定容。冷藏备用。

磷酸盐缓冲溶液的配制：精密称取磷酸二氢钾1.7057 g和氢氧化钠0.2402 g，混合，加蒸馏水搅拌溶解完全后再倒入250 mL容量瓶里定容至刻度线凹液面。

酪氨酸对照液的配制：精密称取0.0102 g 酪氨酸，加10 mL 0.02 mol/mL氢氧化钠溶液，试剂完全溶解后用玻璃棒引流溶液到容量瓶中，用蒸馏水定容到100 mL。

供试品溶液：称取黄精样品粉末2.0000 g，量取30 mL 70%的乙醇进行超声45 min，进行超声提取2次，使用真空泵进行抽滤，合并抽出的滤液，使用旋转蒸发仪蒸发液体回收乙醇，直到没有乙醇气味，再用蒸馏水对浸膏溶解定容至50 mL。

1.2.3 氨基酸标准曲线的绘制

用移液管量取0.1 mg/mL酪氨酸对照液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL放入7个50 mL容量瓶，分别滴加2%茚三酮溶液1 mL、缓冲溶液2 mL，摇匀水浴加热15 min，取出冷却，加蒸馏水至刻度线，得到7组样液，浓度分别为0.00 μg/mL、2.00 μg/mL、4.00 μg/mL、6.00 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL的溶液，用酶标仪检测其吸光度，参照文献[11]波长在570 nm处可得到相应的吸光值，得到氨基酸标准曲线图和线性回归方程y=0.031x+0.0191，R2=0.9982，说明酪氨酸在2.00～12.00 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。图1为标准曲线图。

图1 标准曲线图Fig.1 Standard curve

1.2.4 黄精总氨基酸的提取方法

称取黄精样品2.0000 g，按一定料液比、一定乙醇浓度，设定提取时间、提取次数，用真空泵过滤，合并滤液，浓缩回收乙醇，加蒸馏水溶解所得的浸膏，定容到50 mL容量瓶。精取2.00 mL样品溶液，分别滴加茚三酮溶液1 mL、磷酸盐缓冲溶液2 mL，溶液均匀混合，用水浴锅加热15 min使其显色，取出冷却，用蒸馏水定容至50 mL，用酶标仪检测吸光度并计算出氨基酸的含量。

1.2.5 黄精总氨基酸含量测定

其中，η是黄精氨基酸含量(%)；c是浓度(mg/mL)；v是体积(mL)；n是稀释倍数；m是原料质量(g)。

1.2.6 单因素实验1.2.6.1 乙醇浓度对总氨基酸提取的影响

称取准备好的黄精样品2.0000 g 5份，倒入烧杯中，分别加浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇30 mL，超声提取2次，抽滤合并滤液，将料液去乙醇至没有醇味，定容到50 mL。分别用移液管取溶液2 mL，以1.2.4项的方法显色，测定吸光度A，代入标准曲线方程式算出样品浓度，再计算总氨基酸含量。

1.2.6.2 料液比对总氨基酸提取的影响

黄精样品2.0000 g 5份，分别倒入烧杯中，提取次数2次、提取时间45 min、乙醇浓度70%，以料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例，分为5个水平，开始超声提取45 min，提取2次，抽滤、合并滤液，将料液去乙醇到无醇味。定容到50 mL，分别取溶液2 mL，按1.2.4项下加“茚三酮”起，依次操作。

1.2.6.3 提取时间对总氨基酸提取的影响

称取黄精样品2.0000 g 5份，分别倒入烧杯中，提取次数、料液比、乙醇浓度分别为2次、1∶15、70%，分别超声提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，提取2次，进行抽滤、合并滤液，将溶液去乙醇至无醇味，以时间从短到长编为1～5号，定容到50 mL，用移液管量取溶液2 mL到50 mL容量瓶中，按1.2.4项下加“茚三酮”起，依次操作。

1.2.6.4 提取次数对总氨基酸提取的影响

准确称取黄精样品2.0000 g 5份，分别倒入烧杯中，把乙醇浓度、料液比、提取时间分别设为70%、1∶15、45 min，分5个水平，超声进行提取，分别提取1～5次，进行抽滤、合并得到的滤液，浓缩回收乙醇，以次数编为1～5号，定容至50 mL，用移液管量取样品溶液2 mL，分别加2 mL磷酸缓冲液和1 mL茚三酮溶液，放入水浴锅中进行加热15 min，取出冷却，定容到50 mL刻度线。

其次，改革开放后历史时期是在改革开放前历史时期基础上的拨乱反正和合乎逻辑的继承发展，没有改革开放后历史时期对中国特色社会主义道路的成功开辟，改革开放前历史时期的成果甚至不能巩固和发展。

1.2.7 正交试验设计

以单因素实验结果为依据，用字母A、B、C、D分别表示乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数，实验设定四因素三水平，来测定黄精氨基酸的含量，设计L9(34)正交表如表1。

表1 L9(34)的正交试验表Tab.1 L9(34)orthogonal test table

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对总氨基酸提取的影响

由表2和图2可知：随着乙醇浓度的升高，提取出来的氨基酸含量也随着增大，当乙醇浓度为70%时所提取的含量最高，所以当浓度为70%左右时对黄精总氨基酸提取是最有利的。

图2 乙醇浓度对总氨基酸提取的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on total amino acids extraction

表2 乙醇浓度对总氨基酸提取的影响Tab.2 Effect of ethanol concentration on total amino acids extraction

2.1.2 料液比对总氨基酸提取的影响

由表3和图3可知：随着料液比提取液的增加，黄精氨基酸含量也随着增多，当料液比为1∶15时氨基酸提取的含量最高，1∶15后提取液的含量反而下降。

表3 料液比对总氨基酸提取的影响Tab.3 Effect of solid-liquid ratio on total amino acids extraction

图3 料液比对总氨基酸提取的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on total amino acids extraction

2.1.3 提取时间对总氨基酸提取的影响

由表4和图4可以看出：随着提取时间的延长，总氨基酸含量也越多，当提取时间为45 min时总氨基酸的含量最多。

表4 提取时间对总氨基酸提取的影响Tab.4 Effect of extraction time on total amino acids extraction

图4 提取时间对总氨基酸提取的影响Fig.4 Effect of extraction time on total amino acids extraction

2.1.4 提取次数对总氨基酸提取的影响

由表5和图5可看出：当提取次数为2次时，黄精氨基酸的含量较高，随着提取次数的增多，提取液中含氨基酸量略高于提取2次的含量，但是趋于平稳状态，所以从实验效率来说，提取次数为2次时最节约时间，有利于氨基酸的提取实验操作。

表5 提取次数对总氨基酸提取的影响Tab.5 Effect of extraction times on total amino acids extraction

图5 提取次数对总氨基酸提取的影响Fig.5 Effect of extraction times on total amino acids extraction

2.2 正交试验结果

以单因素实验结果为依据，用字母A、B、C、D分别表示乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数，实验设定四因素三水平，设计L9(34)正交表如表6。

表6 水平因素表Tab.6 Table of levels and factors

表7为正交试验结果分析，由表7可知：正交试验提取出来的最佳工艺为A2B3C2D2。在黄精总氨基酸提取的影响因素中，影响总氨基酸最主要的因素是乙醇浓度，影响的次要的因素是提取次数，影响最小的是提取时间和料液比。

表7 正交试验结果Tab.7 Results of orthogonal test

2.3 正交试验结果验证

为了试验的准确性，用A2B3C2D2的条件，取3次黄精样品进行验证，结果如表8所示。

表8 正交试验结果验证表Tab.8 Verification of experimental results

RSD=0.44%，说明黄精氨基酸在这个提取工艺下是可行的。

3 结论

本实验探索了超声波辅助提取黄精总氨基酸的最佳工艺条件，为黄精总氨基酸的提取和综合利用奠定基础。在单因素实验提取溶剂的浓度、液料比、提取的时间、超声提取次数的基础上，通过正交试验得到超声波提取黄精总氨基酸最好的提取条件为乙醇浓度为70%，料液比为1∶15，提取时间是45 min，提取次数是2次；对提取氨基酸的影响大小顺序是：乙醇浓度>提取次数>料液比>提取时间。最后通过对结果的验证，说明了黄精氨基酸在这个提取工艺下是可行的。