多黏菌素耐药基因mcr-1重组酶介导扩增方法的建立及应用

车勇良，陈秋勇，陈如敬，吴学敏，王隆柏，刘玉涛，周伦江

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州 350013)

抗生素是抵抗人类和动物细菌感染最重要的药物。然而，由于抗生素被大量不合理使用，导致了耐药菌株的大量产生，给全球公共卫生和食品安全带来了巨大威胁。多黏菌素作为人类抵抗细菌感染的最后“一道防线”，也相继出现了大量耐药菌株[1-3]。mcr-1作为一种多黏菌素耐药基因，一经发现，就引起了全世界的广泛关注[4-5]。随之，为了更好地检测mcr-1基因，建立了多种检测方法，其中包括普通PCR方法[4]、荧光定量PCR方法[6-8]。

重组酶介导扩增方法 (recombinase-aided amplification assay,RAA)是近年创建的一种新的检测核酸的方法[9-10]。通过设计一对RAA特异性引物(引物长度30 bp左右)，在源于细菌或真菌的重组酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白的共同作用下，完成目的片段的RAA扩增，并结合特异性荧光标记或金颗粒标记探针，通过荧光定量显示仪或金标试纸进行结果判断。该方法具有灵敏度高、特异性好、检测时间短、恒温扩增、不需要昂贵仪器、结果判断方法多样等多种优势[9-10]。

本研究以多黏菌素耐药基因mcr-1为研究对象，设计一对特异性引物和荧光标记探针，通过反应体系和反应程序的优化，建立了一种快速、敏感且特异的检测mcr-1基因的RAA方法，为多黏菌素耐药基因的流行病学调查和耐药分子机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 多黏菌素耐药基因mcr-1阳性的大肠埃希氏菌菌株由福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心保存，mcr-1阴性的沙门氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌和摩根摩氏菌均由福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心保存。4株临床分离细菌来自福建省2个猪场的猪粪样品，4株细菌均为大肠埃希氏菌菌株。

1.1.2 主要试剂与仪器 细菌DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和PCR试剂，北京全式金生物技术有限公司产品；RAA基础扩增试剂盒和荧光检测试剂盒，杭州众测生物科技有限公司产品。PCR仪，Eppendorf公司产品；荧光定量PCR仪(RTQ-960 Pro型)，艾康生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA提取 复苏细菌，挑取单个菌落接种液体培养基，37℃振摇培养至对数生长期(OD600=0.6)，3 000 r/min离心收集细菌，按照试剂盒说明书用细菌DNA抽提试剂盒提取大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、克雷伯氏菌和摩根摩氏菌的基因组DNA。

1.2.2 引物和探针的设计 根据GenBank中多黏菌素耐药基因mcr-1的保守片段及重组酶扩增方法(RAA)的引物设计原则，设计2对PCR引物及其探针(表1)。并且根据文献[11]合成一对PCR引物。

表1 设计的引物和探针

1.2.3 多黏菌素耐药基因mcr-1的PCR扩增、克隆及序列测定 按照文献[11]应用特异性引物(mcr1-F和mcr1-R)对多黏菌素耐药的大肠埃希氏菌基因组进行PCR扩增，并回收PCR片段，与克隆质粒pMD18-T进行连接，转化感受态细菌DH5α，阳性鉴定后扩大培养并提取阳性质粒送测序公司进行序列测定。所测序列与GenBank中的mcr-1序列进行同源性比较，以确认是多黏菌素耐药基因mcr-1。

1.2.4 RAA基础扩增体系及扩增条件 按照RAA基础试剂盒说明书配制反应体系。反应体系总体积为50 μL，包括A buffer37.5 μL、mcr-F1(mcr-F2) 4.0 μL、mcr-R1(mcr-R2) 4.0 μL、DNA模板2.0 μL，最后在盖子上加入B buffer 2.5 μL。瞬时离心混匀后，放入恒温水浴锅中，按照以下反应程序进行扩增。39℃反应40 s，39℃反应30 s、40个循环。使用扩增产物纯化试剂盒纯化扩增后的RAA产物，电泳检测。

1.2.5 RAA荧光扩增体系及扩增条件 按照RAA荧光试剂盒说明书配制反应体系。反应体系总体积为50 μL，包括A buffer 36.9 μL、引物F 4.0 μL、引物R 4.0 μL、探针(10 μmol/L)0.6 μL、DNA模板2.0 μL，最后在盖子上加入B buffer 2.5 μL。瞬时离心混匀后，放入荧光定量PCR仪中，按照以下反应程序进行扩增。39℃反应40 s，39℃反应30 s，40个循环，收集荧光。

1.2.6 敏感性测定 把mcr-1阳性质粒稀释成4个梯度进行敏感度验证，分别为101拷贝/μL、102拷贝/μL、103拷贝/μL、104拷贝/μL，应用RAA荧光检测试剂盒进行检测。

1.2.7 特异性检测 分别以大肠埃希氏菌(mcr-1阳性)、沙门氏菌(mcr-1阴性)、志贺氏菌(mcr-1阴性)、克雷伯氏菌(mcr-1阴性)和摩根摩氏菌(mcr-1阴性)的基因组DNA为模板，应用建立的RAA方法对其进行检测。

1.2.8 临床应用 应用所建立的RAA方法对临床分离的细菌基因组DNA进行检测，验证其实用性。

2 结果

2.1 mcr-1的PCR扩增、克隆及测序

PCR鉴定结果显示了目的条带320 bp(图1)。并挑选阳性细菌进行克隆，提取阳性质粒进行测序，所测序列与GenBank中的mcr-1序列同源性达到了99%。

M.DNA标准DL 2 000；1.mcr-1基因阳性质粒1；2.mcr-1基因阳性质粒2

2.2 mcr-1基因的RAA扩增结果

按照RAA扩增条件，使用引物mcr-F1和mcr-R1或引物mcr-F2和mcr-R2的扩增结果基本一致，都可以扩增出156 bp的目的片段(图2)。

M.DNA标准DL 2 000；1.mcr-F1(R1)引物的基础RAA扩增；2.mcr-F2(R2)引物的基础RAA扩增

2.3 敏感性验证

将含有mcr-1基因保守片段的质粒稀释成4个梯度，检测不同拷贝数的质粒DNA的扩增(图3)，该RAA方法最低可检测出102拷贝/μL的质粒DNA。

1.阳性对照; 2.104拷贝; 3.103拷贝; 4.102拷贝; 5.101拷贝; 6.阴性对照

2.4 特异性验证

分别对mcr-1基因阳性的大肠埃希氏菌基因组DNA和mcr-1基因阴性的其他各种细菌基因组DNA进行荧光RAA检测。结果显示，只有mcr-1基因阳性的大肠埃希氏菌基因组DNA能被检测出mcr-1基因，其他4种细菌基因组DNA未被检测出mcr-1基因(图4)。

1.mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌; 2.阳性对照; 3-7.其他mcr-1基因阴性细菌和阴性对照

2.5 RAA方法的临床应用

应用所建立的mcr-1基因RAA方法检测临床分离细菌，从4份样品中检测出2份阳性样品，2份阴性样品(图5)。

1.mcr-1基因阳性样品; 2.阳性对照; 3.mcr-1基因阳性样品; 4.mcr-1基因阴性样品; 5.mcr-1基因阴性样品; 6.阴性对照

3 讨论

本研究选取mcr-1基因的保守片段为目的片段，并根据该片段，设计了一对特异性引物和一条特异性探针，建立了检测耐药基因mcr-1的RAA方法。这对特异性引物和探针在mcr-1基因中高度保守，适宜用来作为分子检测的目的基因。特异性试验结果表明该RAA方法只能检测到mcr-1阳性基因，进一步验证了该方法的特异性。

RAA方法在应用于检测时敏感性高[9-10]，本研究设计的特异引物和探针所建立的检测mcr-1耐药基因的RAA技术，最低可检测到102拷贝/μL的mcr-1基因阳性质粒，表明该方法具有高度的敏感性。检测多黏菌素耐药基因mcr-1的方法主要是PCR和荧光定量PCR，这些方法不仅耗时，而且价格昂贵。RAA方法不仅具有更高的敏感性，而且耗时较短；因为是恒温扩增，无需专有仪器，只需要恒温水浴锅就能运行，且结果判断有3种方式，分别为凝胶电泳、荧光定量曲线和金标试纸[9-10,12-15]。

本研究选取多黏菌素耐药基因mcr-1为研究对象，通过设计特异性引物和探针，优化扩增条件，建立了一种快速、特异性好且高度敏感能检测mcr-1基因的RAA方法，这将为多黏菌素耐药基因mcr-1的流行病学调查及耐药机制的研究奠定基础。