猪MORC2 基因启动子区克隆、鉴定与分析

刘吉英，罗刚，司徒旭祺，李木旺

（江苏科技大学生物技术学院，江苏镇江 212018）

MORC2（Microrchidia Family CW-type Zinc Finger 2，ZCWCC1）蛋白是MORC 蛋白家族的一员，是新的表观调控蛋白，在植物、线虫、哺乳动物不同发育阶段起到重要作用。MORC2 蛋白主要包括氨基（N）端高度保守的GHKL 型-ATP 酶结构域、CC 结构域、CW 锌指结构域。是腓骨肌萎缩症新致病基因。越来越多的研究表明，MORC2 蛋白作为新表观遗传调控蛋白是细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化等过程中重要的调控因子。MORC2 主要通过识别组蛋白修饰或与组蛋白修饰酶相互作用或甲基化修饰影响细胞增殖与存活。同时，MORC2 作为染色质重塑蛋白，主要参与DNA 依赖的ATP 酶活性调节染色质重塑，促进DNA 双链断裂修复调控细胞凋亡。MORC2 通过促进组蛋白H2AX 磷酸化，促进DNA 损伤修复进而影响细胞存活。除此之外，MORC2 还可以与DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）形成复合体，使其靶基因DNA 超甲基化，或者作为转录因子直接结合在基因的启动子区抑制靶基因转录，最终影响细胞存活。由此可见，MORC2 作为表观遗传因子调控基因表达的方式有多种。目前关于基因的研究处于起始阶段，基因的功能、表达调控和作用机制目前研究还不透彻。

在睾丸和卵巢中均高表达，小鼠同源基因MORC2b 被报道为PRDM9 的转录调控靶点。PRDM9 是一种组蛋白H3 三甲基转移酶，是减数分裂过程中必需的，PRDM9 通过MORC2 参与调控生殖细胞的形成。MORC2b 失活导致包括减数分裂特异性基因在内的许多基因的错误表达。敲除的成年小鼠的卵巢组织中没有成熟的卵泡，雌性敲除小鼠生殖功能丧失。可见，基因可能参与了卵巢发育过程调控，但是基因在大型家畜例如猪的卵巢发育过程中的功能未知。本研究通过克隆测序技术获得猪基因启动子区序列，通过构建启动子区双荧光素酶缺失载体鉴定猪基因的核心启动子区，通过生物信息学软件分析猪启动子区序列特征，预测与卵巢发育和卵泡闭锁相关的转录因子结合位点，以期为研究猪基因的表达调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 KOD OnePCR Master Mix（KMM-201，TOBOYO）购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。限制性内切酶I、I、T4 DNA 连接酶购自TAKARA 公司；DNA 提取试剂盒、质粒pRLTK、pGL3-basic 购自生物工程（上海）股份有限公司；DH5感受态细胞、无内毒素质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；细胞转染试剂（T101-01）和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（DL101-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。胎牛血清（Gibco）、0.25%胰蛋白酶、双抗（青链霉素）、DMEM（11995）、DMEM/F12 均购于Therom Fisher Science，人胚肾细胞（293T）由实验室保存。

1.2 猪基因5' 调控区片段扩增及生物学分析 屠宰场取猪卵巢迅速放入液氮保存，利用DNA 提取试剂盒提取猪的基因组DNA。根据猪基因（NC_010456.5）序列，取ATG 前1 936 bp 序列作为模板设计引物。利用生物学分析软件对核心启动子区进行预测与分析。使用Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）、PromoterScan（http://wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）、Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=promoter）、BDGP（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）等软件对基因进行启动子分析；用CpGFinder 对目的基因可能含有的CpG 岛进行分析；PROMO（http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）和JASPAR（http://jaspar.genereg.net/ ）等对启动子区转录因子与结合位点进行预测分析。

1.3 双荧光素酶缺失载体构建和鉴定 根据核心启动子预测软件的预测结果，利用Primer 5 设计引物，共设计6 条上游引物，下游引物相同，为pMORC2-R，上下游引物的5'端分别加入I、I 酶切位点（引物设计信息见表1）。PCR 片段使用东洋纺高保真酶KMM-201 进行扩增，PCR 扩增体系为50 μL：1 μL KMM-201高保真酶，上下游引物各15 pmol，DNA 模板200 ng，补ddHO 至50 μL。PCR 反应条件为：98℃ 10 s；98℃10 s，68℃ 20 s，共40 个循环；72℃ 7 min。扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，双酶切，酶切产物用DNA 产物纯化试剂盒纯化后利用T4 DNA 连接酶连接到pGL3-Basic 载体上，重组质粒经I、I 双酶切鉴定后送杭州尚亚生物公司进行测序，测序结果与模板DNA 比对后确定载体构建是否成功。

表1 引物信息

1.4 细胞培养 将生长状态良好的293T 细胞（培养基含10% FBS+90% DMEM）汇合至80% 左右时接种于24 孔板，置于37℃、5% 的CO培养箱中培养，待细胞汇合度达70%～80%时进行转染。屠宰场取猪卵巢，置于37℃生理盐水中，并在2 h 内运回实验室，用含2%双抗的PBS 冲洗3 次，并用酒精棉擦拭卵巢表面避免污染。用10 mL 注射器抽取卵泡液，800 g 离心5 min。弃上清，收集细胞，用含1% 双抗的PBS 洗2 次，离心弃上清。将细胞接种在24 孔板（培养基为10%FBS+90% DMEM/F12），待细胞汇合度达70%～80%时进行转染。

1.5 细胞瞬时转染及荧光素酶活性测定 将构建好的质粒转化到大肠杆菌中，提取无内毒质粒。利用转染试剂ExFect Transfection Reagent 将构建好的质粒转染到细胞内，pGL3-Basic 为对照组，pRL-TK 为内参。转染后24 h，收集细胞裂解液。根据双荧光素酶试剂盒说明书检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性值，通过计算比值获得相对荧光素酶活性值，确定猪基因核心启动子区。

1.6 数据分析 相对荧光素酶活性数据使用SPSS 16.0软件进行检验分析。其中<0.05 表示差异显著，<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 猪基因5' 调控区扩增 以猪的基因组DNA 为模板，使用引物P1（表1）扩增猪基因ATG 前1 936 bp 序列，扩增产物如图1 所示，经测序比对发现与引物源序列一致性为99.73 %，说明成功扩增出猪基因5'调控区。

图1 猪MORC2 基因5'调控区PCR 扩增产物电泳图谱

2.2 构建猪基因5'调控区双荧光素酶缺失载体根据在线启动子预测软件预测结果构建猪基因启动子区不同片段荧光素酶报告载体（图2A），分别命名为pMORC2-630（-1～-630）、pMORC2-1075（-1～-1 075）、pMORC2-1207（-1～-1 207）、pMORC2-1347（-1～-1 347）、pMORC2-1479（-1～-1 479）、pMORC2-1936（-1～-1 936）。利用表1 中的引物扩增猪基因启动子区不同长度片段，PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2B 所示。扩增产物经双酶切后连接到pGL3-Basic 载体上，经酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2C 所示。构建好的载体经测序比对确定插入序列的序列正确，说明成功构建猪基因5' 调控区双荧光素酶缺失载体。

图2 猪MORC2 基因启动子区双荧光素酶缺失载体构建、扩增及双酶切鉴定

2.3 猪基因核心启动子区鉴定 将以上构建好的质粒分别转染工具细胞293T 和猪卵泡颗粒细胞，PRL-TK 为内参质粒，pGL3-Basic 为对照质粒，转染后24 h 收集细胞裂解液进行双荧光素酶活性分析，结果如图3 所示。图3A 为转染293T 细胞后的相对荧光素酶活性，图3B 为转染猪卵泡颗粒细胞后的相对荧光素酶活性。结果显示，在2 种细胞中基因启动子的活性趋势基本相同，pMORC2-1347、pMORC2-1479 和pMORC2-1936 相对荧光素酶活性均极显著高于pGL3-Basic，说明猪基因-1207～-1347 含有MORC2启动子重要的正调控元件，是猪基因的核心启动子区。另外，pMORC2-1936 片段的荧光素酶活性与核心启动子区相比有所下降，表明该区域（-1479～-1936）可能含有基因的负转录调控原件。

图3 猪MORC2 基因核心启动子鉴定

2.4 猪基因核心启动子区CpG 岛和调控元件分析 经在线网站预测，发现猪基因启动子区存在1 个CpG 岛，长度为1 152 bp，位于-682～-1834，如图4 所示，表明基因表达可能受甲基化影响。该CpG 岛与猪核心启动子区有重叠，并且在猪基因核心启动子区发现了TATA-box、E-box、GC-box、SP1 和NF1 等多个调控元件，如图5 所示，更加确定该区域是猪基因的核心启动子区。

图4 猪MORC2 基因5'调控区CpG 岛预测结果

图5 猪MORC2 基因5'调控区核苷酸序列

2.5 猪启动子区转录因子预测 利用在线转录因子预测软件分析猪基因启动子区可能的转录因子，发现存在110 种转录因子结合位点。其中与卵巢发育和颗粒细胞功能相关的转录因子FOXO1、YY1、SMAD4 和E2F1 等在猪基因启动子区有潜在的结合位点，如表2 所示。这些结合位点的核苷酸序列在不同物种间高度保守，提示基因可能参与了猪的卵巢发育和颗粒细胞功能调控。

表2 猪MORC2 基因启动子区域转录因子结合位点预测结果

3 讨 论

卵巢发育和卵泡闭锁是影响母猪繁殖力的重要因素，卵泡颗粒细胞在卵巢发育和排卵过程中起到重要作用，研究与卵巢发育和颗粒细胞功能相关的基因表达调控有利于揭示猪的繁殖性状相关机制。MORC2属于MORC 家族蛋白，广泛参与基因转录调控、表观遗传调控以及DNA 损伤修复。目前研究最多的是在癌症中的调控，该基因在胃癌和乳腺癌等多种癌症中高表达，参与癌细胞增殖、侵袭及迁移的调控。核定位显示MORC2 主要集中在细胞核中，也暗示了基因功能与基因的表达调控相关。目前关于基因与哺乳动物繁殖力相关的研究很少，仅在小鼠中有研究。基因敲除小鼠的卵巢不能形成成熟的卵泡，并且卵母细胞发生凋亡，表明基因是卵巢发育所必须的，但其调控机制尚不清楚。为了研究基因与卵巢发育和卵泡闭锁的关系，本研究鉴定出基因5'调控区核心启动子区位置，为今后研究该基因表达调控机制提供参考依据。

预测分析发现在基因的5' 调控区含有多个与卵巢发育和颗粒细胞功能调控相关的关键转录因子结合位点，如FOXO1、YY1、SMAD4 和E2F1 等。FOXO1 转录因子被认为是调节氧化应激和细胞凋亡的关键介质。氧化应激可诱导颗粒细胞凋亡，导致卵泡闭锁，从而降低产仔数。氧化应激上调FOXO1 导致颗粒细胞凋亡，最终引起小鼠卵泡发生闭锁。FSHFOXO1 信号通路通过抑制自噬来防御颗粒细胞氧化损伤，有证据表明磷酸化的MORC2 减少了与热休克蛋白家族A 成员8（HSPA8）和溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）的相互作用，从而保护MORC2 免受分子伴侣介导的溶酶体的降解。本研究发现猪是FOXO1 潜在的作用靶基因，FOXO1 可能通过调控MORC2 进而调控猪的卵泡闭锁。YY1 作为转录因子参与了多种基因激活或沉默的调控，研究已经证实YY1 参与了小鼠卵泡发育和卵巢功能，是卵母细胞-颗粒细胞通信所必须的。YY1 还可以直接与长链非编码RNA X 染色体失活特异性转录物（long non-coding RNA X-inactive-specific transcript，lncRNA Xist）启动子结合，促进在围产期小鼠卵巢中的表达。YY1 可以显著提高FSHR 核心启动子的转录活性，促进FSH的传导。SMAD4 是转化生长因子信号通路的核心分子，与哺乳动物生殖能力和卵泡发育密切相关，TGF-/SMAD 信号通路通过与miR-183-96-182 簇/FOXO1 抑制颗粒细胞凋亡。研究者前期发现SMAD4 参与TGF-/SMAD 信号通路对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控。MORC2 调控线粒体凋亡途径可能是p53 依赖的方式，其调控异常也导致Hippo 途径的异常激活，表明MORC2 是重要的凋亡调控蛋白。本研究发现基因可能作为新的调控因子参与猪卵巢颗粒细胞功能调控，后续将对该假设进行验证。E2F1 是E2F 转录因子家族的成员，是视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，Rb）的下游效应因子，调控DNA合成和复制在内的多种细胞学行为。基因敲除可提高启动子的活性，调控猪颗粒细胞的生长和雌二醇的合成，进而参与卵泡发育。MORC2作为重要的细胞增殖因子促进多种细胞癌增殖，在正常细胞中的研究比较少，在C2C12 细胞中MORC2 通过抑制细胞分化维持细胞周期。鉴于是细胞增殖与凋亡重要的调控基因，研究猪基因表达调控有利于研究猪卵泡颗粒细胞增殖凋亡调控。本研究发现在基因的5'调控区含有多种转录因子结合位点，进一步提示可能参与了卵巢发育或颗粒细胞功能的调控。本研究获得了基因的核心启动子区，后续将着重研究这些转录因子通过MORC2 调控猪卵巢发育和颗粒细胞功能的机制。

4 结 论

本研究利用双荧光素酶报告系统鉴定了猪基因的核心启动子区（-1207～-1347），并发现在该基因的5'调控区含有CpG 岛，以及与卵巢发育和颗粒细胞功能相关的转录因子结合位点。上述研究为解析猪基因在卵巢发育和卵泡闭锁中的功能提供理论依据。