干扰Cul5 对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

曾雨晗，胡德宝，李新，张林林，丁向彬，郭宏，郭益文

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384）

骨骼肌卫星细胞（MSC）是对骨骼肌起作用的细胞，也被称为肌原干细胞，通常在骨骼肌发生损伤或产生疾病后被大量激活，从而维持着骨骼肌的稳态。而MSC 的细胞周期离不开多种蛋白的参与。这些蛋白在细胞中的表达水平很大程度取决于泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的蛋白质降解的调控作用。人体内有两大蛋白降解系统：溶酶体-自噬系统和UPS 系统，UPS系统负责体内80%的蛋白降解。该系统由E1、E2、E3 3 种泛素酶及26 s 蛋白酶体组成。其中E3 泛素连接酶是将Ub 与底物蛋白连接并传递到26 s 蛋白酶体进行识别的关键一步。在牛上泛素连接酶库伦-5（Cullin5，Cul5）位于第15 号染色体，是库伦家族的成员之一，由780 个氨基酸组成。作为E3 连接酶复合物的核心蛋白，Cul5 参与多种细胞活动，并发挥至关重要的骨架支撑作用。Cul5 分布在多种组织细胞内，在心肌及骨骼肌细胞中呈现高表达。在细胞处于增殖期且活性增高时，Cul5 被认为可发挥促进增殖的作用，并在细胞周期、细胞的成肌分化、肿瘤的发生等多种疾病过程中发挥重要调控作用。在小鼠囊胚细胞中，敲除Cul5 致使胚胎细胞缺陷。体外表达磷酸化位点突变的Cul5 可促进大鼠内皮细胞增殖。在疾病的发生与进程中，Cul5 的敲除或过表达，参与HIV、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤的调控过程。Cul5 对细胞的增殖分化有着重要的调控作用，但该基因对骨骼肌的调控作用尚不清楚，对牛骨骼肌细胞的影响研究更是少之又少。本研究采用牛骨骼肌卫星细胞体外模型，模拟骨骼肌的增殖分化过程，通过敲低Cul5 的表达，探究Cul5 对牛肌卫星细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源 实验室预先分离并冻存的初代牛骨骼肌卫星细胞。

1.1.2 主要试剂 高糖培养基；胎牛、马血清；Lip 3000转染试剂（Invitrogen）；蛋白质快速裂解液、5×Tris电泳缓冲液、10×电转缓冲液、紫外线超敏发光液A、B 液（索莱宝，北京）、20×TBS 缓冲液；Pax7 一抗（ProteinTech）；MyHC 一抗（DSHB）；Tubulin 一抗（DSHB）；Cul5 一抗（Santa Cruz Biotechnology）。

1.1.3 主要仪器 细胞培养箱、荧光倒置显微镜（Leica）、实时荧光定量PCR 仪、凝胶电泳仪（Bio-Rad）、免疫印迹条带曝光仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 牛骨骼肌卫星细胞的分离培养参考天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室已建立的方法进行，复苏冻存的骨骼肌卫星细胞，用添加1%链霉素的增殖培养基（1% 青霉素+20%FBS 胎牛血清+79% 高糖血清）培养细胞3～4 d，观察细胞量占培养皿表面积60%～70%时进行传代实验，将细胞传入与实验相对应的细胞培养板中，6 孔板用于蛋白提取，24 孔板用于RNA 提取，96 孔板用于EDU 实验。用未含抗生素（20%FBS 胎牛血清+80% 高糖血清）的增殖培养基继续培养，当孔板中的细胞量占培养皿表面积的60%～80%后，进行脂质体瞬时转染或更换为分化培养基（1%青霉素+2%HS 马血清+79%DMEM）继续培养。

1.2.2 细胞转染 查找Cul5 序列（来自NCBI 数据库），设计并合成实验组si-RNA 和对照组si-NC，待细胞量占培养皿表面积的70%时进行转染。每孔吸弃200 μL（6孔细胞培养板）、50 μL（24 孔细胞培养板）、10 μL（96孔细胞培养板）培养基，将配置好的转染液（依照Lip 3000 转染说明书添加）加入细胞中6 h 后，更换含有抗生素的增殖培养基，继续培养48 h。

1.2.3 RNA 的提取 用无酶的磷酸缓冲液清洗细胞2 次后，加入RNA 裂解液静置5 min，后续参照RNA 提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 蛋白的提取 用普通的磷酸缓冲液清洗细胞2 次后，加入200～250 μL 含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液（稀释比例为1:100），收集细胞后低温离心10 min（12 000 r/min，4℃），吸取上清用作后续实验或保存于-80℃冰箱。

1.2.5 EdU 细胞增殖实验 将转染后增殖24 h 的细胞，按EDU 试剂盒操作。在细胞水平上探寻Cul5 对MSC增殖的影响。

1.2.6 实时荧光定量PCR 检测Cul5 的干扰效率及增殖、分化标志因子的mRNA 表达量，引物信息Cul5 上游引物：GCAGAGTGCCAAGGCATGAT，下游引物：AGGCCCGCACTGATGATATG；Pax7 上游引物：AGC CAGAGTTTCAACGGGAG，下游引物：GTCGCCAAC AGACAACACAC；Ki-67 上游引物：GAGGTGGCTCA GGTTCGTC，下游引物：AAAGGGTTGGTGGTAAGT GGC；MyHC 上游引物：CTGGAATCCGGAGGCAGA A，下游引物：TTTTCGAAGGTAGGGAGCGG；MyOG上游引物：GGCTGACAAATGCCAGACTATCC，下游引 物：TGGTCCCTTGCTTTATCTCCCT；Tublin上游引物：CAACAGCACAGCCATCCAGGA，下游引物：TCTCAGCCTCGGTGAACTCCAT。

反应试剂及体系为：cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×All-in-One ™ qPCR Mix 10 μL，RNase free water 7 μL。荧光定量PCR 程序：预变性：95 ℃，60 s；变性：95 ℃，10 s；退火：61 ℃，20 s；延伸：72℃，15 s；变性、退火、延伸共35 个循环；熔解曲线：95℃ 10 s；65℃，60 s；97℃，1 s；冷却：37℃，30 s。

1.2.7 Western Blot 检测增殖标志因子、分化标志因子的蛋白表达量。将增殖第1 天（24 h）和分化第1、2、3 天（24、48、72 h）的细胞用裂解液裂解并收集蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，根据浓度按比例加入Buffer并100 ℃加热10 min 使蛋白变性。通过Western Blot技术检测增殖标志因子Pax7 分化标志因子MyHC 蛋白的表达量。

1.3 统计分析 荧光定量PCR 和Western Blot 的结果用检验分析（SPASS 和Image Lab）；EdU 阳性细胞率卡方检验分析。

2 结果

2.1 检测肌卫星细胞增殖及分化前后Cul5 的表达量提取牛骨骼肌卫星细胞增殖第1 天（24 h）及分化后3天（24、48、72 h）的RNA 和蛋白，结果可见，Cul5在mRNA 及蛋白水平上的表达量存在显著差异（图1），均为分化期显著高于增殖期。

图1 Western Blot 及qRT-PCR 检测牛骨骼肌卫星细胞增殖期(GM）及分化1、2、3 d（DM1、DM2、DM3）Cul5 蛋白及mRNA 表达水平

2.2 Cul5 si-RNA 干扰的筛选 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上查找Cul5 序列，设计3 条si-RNA 将其命名为（si-Cul5-1、si-Cul5-2、si-Cul5-3），结果如图2 所示。可见，在mRNA 水平上设计3 条si-RNA 与对照组相比均具有极显著的干扰效果，其中si-Cul5-2的干扰效果最明显。在蛋白水平上验证si-Cul5-2 的干扰效果，结果也呈极显著趋势，所以将si-Cul5-2 用作后续实验。

图2 Western Blot 及qRT-PCR 检测牛骨骼肌卫星细胞转染si-Cul5-2 后Cul5 表达量

2.3 干扰Cul5 对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响 于96孔板中培养细胞并转染Cul5 的小干扰RNA，结果如图3 所示，干扰Cul5 后，细胞增殖EdU 阳性率与对照组相比极显著上调。结果表明，敲低Cul5 对牛骨骼肌卫星细胞的增殖有作用。

图3 EdU 检测干扰Cul5 后牛骨骼卫星细胞的增殖情况

在24 孔板中培养细胞并转染Cul5 的小干扰RNA，提取细胞中的RNA。如图4 所示，增殖标志因子Ki-67、Pax7 均无显著变化，提示干扰Cul5 在mRNA 水平上对细胞增殖无显著影响。

图4 qRT-PCR 检测牛骨骼肌卫星细胞转染si-Cul5-2后Pax7、Ki-67 表达量

在6 孔板中培养细胞并转染Cul5 的小干扰RNA，提取细胞中的总蛋白。如图5 所示，增殖标志因子Pax7 显著增高（<0.05），结果表明干扰Cul5 在蛋白水平上对细胞增殖有促进作用。

图5 qRT-PCR 检测牛骨骼肌卫星细胞转染si-Cul5-2 后Pax7、Ki-67 表达量

2.4 干扰Cul5 对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响 在24孔板中培养细胞并转染Cul5 的小干扰RNA，更换分化培养基后继续培养72 h，采用光学显微镜观察细胞肌管的形成状态。如图6 所示，干扰Cul5 后骨骼肌卫星细胞的肌管数量明显少于对照组。

图6 干扰Cul5 后细胞在100 倍镜下的光镜图

在24 孔板中培养细胞并转染Cul5 的小干扰RNA，提取细胞中的RNA，如图7 所示，可见分化标志因子MyHC、MyOG 均无显著变化，提示干扰Cul5在转录水平上对细胞分化无显著影响。

图7 qRT-PCR 检测牛骨骼肌卫星细胞转染si-Cul5-2 后MyHC、MyOG 表达量

在6 孔板中培养细胞并转染Cul5 的小干扰RNA，提取细胞中的总蛋白，如图8 所示，可见分化标志因子MyHC 显著降低，结果表明干扰Cul5 在蛋白水平上对细胞分化有抑制作用。

图8 qRT-PCR 检测牛骨骼肌卫星细胞转染si-Cul5-2 后MyHC 蛋白表达量

3 讨 论

MSC 位于肌纤维膜和细胞外基质之间，当其受到外界刺激被激活后，将启动卫星细胞的一系列反应机制并成长为成熟肌纤维，在这个过程中MSC 起到修复细胞和维持细胞稳态的作用。机体内最主要降解蛋白质的途径是UPS 系统，其在调节蛋白质平衡和维持蛋白质稳态方面的重要性不言而喻。同时UPS 在DNA 损伤和修复、细胞增殖、分化等多种细胞调节方面也有着不可忽视的作用。UPS 是多步骤反应过程，通过对泛素分子传递的连级反应，对底物蛋白进行泛素化标记，使其被降解。E3 连接酶则起着传递泛素分子和连接底物蛋白的重要作用。Cul5 作为E3 泛素连接酶的核心骨架成分，在多种细胞中都表现出抑制增殖的效果。研究报道，降低Cul5 的表达对小鼠肺癌细胞的增殖有调控作用，并可抑制癌细胞的迁移。Cul5 也可通过调节线粒体活性蛋白激酶（AMPK）的磷酸化，影响细胞因子的mRNA 和蛋白质的表达，从而调节细胞周期、细胞凋亡和DNA 修复等生物过程。目前，前人对Cul5 的研究侧重于其在癌细胞中的表达和癌症发展，对肌肉的调控以及在牛上的实验很少。所以本实验以Cul5 为实验目标，以牛骨骼肌卫星细胞为基础展开实验。结果显示，分化前后mRNA 和蛋白水平上Cul5 表达量均有显著变化，均在分化期表达量较高，提示Cul5 可能对细胞分化有调控作用。然而，敲低Cul5 后，在mRNA 水平上，该基因对增殖及分化标志因子均无显著影响，但在蛋白水平上却影响显著，即Pax7 显著增高，MyHC 显著下降。造成这一现象的原因可能在于Cul5 是通过其翻译后修饰进而表达蛋白，发挥影响细胞进程的作用。也有相关文献说明这一观点。在大鼠肾上腺髓内皮细胞中VACM-1/Cul5 的抗增殖效果取决于其后翻译修饰。本研究表明Cul5 对牛骨骼肌卫星细胞的增殖分化有重要的调控作用。Cul5 的功能具有组织特异性，在不同组织中发挥着不同作用。研究发现，Cul5 在大鼠内皮细胞促进其增殖，但在小鼠肾小球足细胞抑制其增殖。基因功能的多变性使不同细胞发挥的调控作用不同，具体机制还待进一步研究。

4 结 论

本研究以牛肌卫星体外成肌诱导分化模型为基础，探寻Cul5 对MSC 的调控作用，通过研究结果可以得出：干扰Cul5 能够促进MSC 的增殖，并抑制其分化过程，可为进一步研究Cul5 在牛肌肉发育分化中的调控机制提供一定参考。