维生素E 对驴精液冷冻保存效果的影响

韩迎雪，高鹏，李楠，曾申明

（中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

精液冷冻保存技术使家畜优秀种质资源的传播与保存不受限制。目前，精液冷冻保存技术在驴产业上的应用越来越广泛。大量研究表明，冷冻保存后的精子活力和存活率远远低于新鲜精子，在冷冻过程中除了受到冷休克、冰晶体的形成和渗透压变化外，精子细胞在冷冻过程中会产生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），过量的ROS 和不饱和脂肪酸产生过氧化反应，破坏精子细胞膜，使精子在冷冻保存过程中易发生脂质过氧化反应并产生过量ROS 造成其质膜和DNA 完整性遭到破坏，易形成低温打击，导致解冻后的精子存活率低、人工授精受胎率不高，从而限制了驴精液冷冻保存技术的广泛推广应用。在稀释液中加入抗氧化剂能有效保护精子在冷冻保存过程受氧化损伤，保护精子并提高其活力。

维生素E 又称-生育酚，不浓于水，也不易被酸、碱破坏，是哺乳动物中一种重要的抗氧化物质。维生素E 能与细胞膜磷脂双层膜结合减少膜的氧化损伤、脂质过氧化，还可调节精子内ROS 浓度，进而保护精子质膜和线粒体的完整性。Bansal 等证实维生素E在冷冻牛精液中可以降低脂质过氧化水平。罗海玲等研究发现在绵羊精液稀液中添加维生素E 可有效保护精子顶体，减少顶体酶的泄露，从而提高精子活力，降低冷冻对精子的损伤，提高绵羊冷冻精液质量。郑自华等研究发现在马精液稀释液中添加维生素E 能提高冷冻后精子活力、顶体完整率和体外存活时间。但是在驴精液稀释液中添加维生素E 的报道还相对较少，有必要进一步研究在精液冷冻稀释液中不同浓度维生素E 对驴精液冷冻保存效果的影响，为提高其在驴精液冷冻保存稀释液中的广泛应用提供实践参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验公驴为6 头3～7 岁有生育能力的德州黑驴，健康无疾病，体重在400 kg 左右。种公驴在国家黑毛驴繁育中心单舍饲养，自由采食、饮水，并每天在遛驴场至少运动30 min。实验母驴为在国家黑毛驴繁育中心随机挑选的40 头健康成年有生育能力的空怀母驴，发情周期正常，无生殖疾病，年龄在2～5 岁。

1.2 实验试剂 葡萄糖（G7021）、乳糖（L2643）、棉子糖（R0250）、柠檬酸钠（C8532）、柠檬酸钾（C3029）、HEPES 试剂（H0527）、-脯氨酸（V900338）、二甲基甲酰胺（D4551）、脱脂奶粉（LP0031）、维生素E（T3634）、FITC-PNA（L7381）均购自默克集团；青霉素（030012659）购自河北远征药品公司；链霉素（H20054140）购自深圳华药南方制药公司；线粒体膜电位检测试剂盒JC-1（c2006）、钙离子荧光探针（S1060）均购自上海碧云天生物技术有限公司；HBSS（H1046）、精子DNA 染色试剂盒（A8120）均购自上海索莱宝生物科技有限公司。

1.3 精液预处理及冷冻精液的制作 用假阴道法采集公驴精液，采集到精液后立即送往实验室进行初步镜检，选择无异味、精子形态正常和活率≥80%的精液，缓慢加入精液稀释液中，稀释液抗冻保护剂为5% 的DMF，另外分别添加0%、1%、2%、4% 和6% 的维生素E，轻轻上下颠倒几次使精子与稀释液充分混合。稀释后的精液被分装0.5 mL 细管中，每根细管约含有2.5×10个精子，移至4℃平衡柜中平衡2 h。取出平衡后的冻精细管，放到精子程序化冷冻仪中，设置好降温曲线，进行精液冷冻。解冻时将冻精细管至于38℃水浴锅30 s 以上，使用计算机辅助精子活力分析分别观察和记录每组精子的精子总运动率（TM）、直线前进运动率（PM）、曲线运动速度（VCL）、平均路径速度（VAP）、直线运动速度（VSL）等运动参数，至少观察5 个视野，统计平均值。其中，冷冻基础稀释液A 液：16 g 脱脂奶粉溶解于200 mL 超纯水中。B 液：葡萄糖10 g、乳糖0.6 g、棉子糖0.6 g、柠檬酸钠0.12 g、柠檬酸钾0.164 g、HEPES 2.984 g、脯氨酸0.921 04 g；灭菌超纯水定容至200 mL。将制备好的A 液和B 液混合后充分混匀，在115℃高压灭菌15 min，室温冷却后加入0.017 5 g青霉素和0.021 g 链霉素，放置于4℃冰箱保存。

1.4 畸形率 将显微镜放大倍数调至200×，恒温台温度调至37℃，打开计算机辅助精子活力分析仪，用移液枪取7 µL 精液滴放在预热载玻片上，盖好载玻片，使精子均分分布。将载玻片放在连接精子活力分析仪的显微镜下，记录正常精子数、畸形数，更换视野重新统计，每个样品统计至少5 个以上视野，统计平均值。

1.5 质膜完整性 采用低渗试验检测膜完整性和精子活力强弱。低渗浓液成分含有枸橼酸钠、-果糖和超纯水。取出冻精细管，把其中的精液注入离心管中，在38℃水浴锅中放置10 min，待活力恢复后检测。观察和记录卷尾精子数和总精子数，每个视野精子数不少于200个，至少连续观察5 个视野，统计平均值。

1.6 顶体完整性 使用花生凝集素异硫氰酸荧光素双染色来评估顶体完整性。将DMEM 培养液和冷冻精液在38℃水浴锅中预热，取FITC-PNA 加入DMEM 培养液充分混匀，避光操作。将精液加入DMEM 培养液颠倒混匀，1500 r/min 离心4 min，弃除上清。在沉淀精子中加入工作液，避光孵育15 min，最后，1 500 r/min离心4 min，弃除上清。加入预热的DMEM 培养液，轻轻吹打混匀后，1 500 r/min 离心4 min，弃除上清。重复上一步操作一次，最终加入洗涤液待测。用流式细胞仪检测，X 轴通道ECG（红光），Y 轴通道FITC（绿光），顶体完整精子的头前部则发出明亮绿光，顶体损伤精子的头前部发光区域不完整或不发光。

1.7 线粒体膜电位 本试验采用线粒体膜电位检测试剂盒检测精子线粒体膜电位，根据说明书详细操作步骤进行操作。

1.8 DNA 完整性 本试验用吖啶橙法检测DNA 完整性，试剂盒为索莱宝公司提供，根据说明书详细操作步骤进行操作。

1.9 线粒体钙含量 采用钙离子荧光探针检测线粒体钙含量，具体步骤为：将精液样品并加入HBSS 溶液颠倒混匀，1 500 r/min 离心4 min，弃除上清；加入工作液，轻轻吹打，避光孵育，1 500 r/min 离心4 min，弃除上清；加入HBSS 溶液，轻轻吹打，1 500 r/min 离心4 min，弃除上清；重复上步操作一次，最终加入HBSS 溶液，调节精子密度至1×10/mL，室温孵育待测。流式细胞仪检测，Fluo-4 可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，激发波长为488 nm 左右，发射波长为512～520 nm。流式细胞仪检测荧光强度,检测细胞数不少于10 000 个，以平均荧光强度值表示线粒体中Ca浓度。

1.10 人工授精 人工授精试验分为鲜精组和冻精组，分别对70 头和40 头母驴进行同期发情处理。试验当天（第0）每头母驴注射1 mL 促性腺激素释放激素（Gonadotrophin Releasing Hormone，GnRH）类似物；在第2 天，将阴道栓埋植在阴道穹窿内；在第8 天，每头母驴肌肉注射4 mL 前列腺素（Prostaglandin，PG）；在第11 天，取出阴道栓，同时每头母驴肌肉注射4 mL PG，撤栓后第5 天内，每天08:00—10:00 用B 超隔直肠壁检测和记录卵泡发育情况，当母驴优势卵泡直径>30 mm 时被视为进入发情期。当母驴优势卵泡直径达到30 mm 以上时肌肉注射GnRH 类似物1 mL，22 h 后检查卵泡排卵情况，对已经排卵的母驴输入鲜精或冷冻精液4 支，每支含有约1.2 亿有效精子，而没有排卵母驴在GnRH 类似物注射后34 h 输精4 支。输精结束后每头母驴注射2 mL 的缩宫素，加速子宫蠕动，促进精子运行。母驴输精后15 d 用直肠超声波检查妊娠状态，如果子宫内出现胚泡，则统计为妊娠，否则统计为空怀。

1.11 统计分析 实验数据使用SPASS 18.0 统计软件进行统计分析，结果用平均数±标准差表示，数据经正态分布检验后，用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异，当<0.05 时，表示差异显著。

2 结果

2.1 在稀释液中添加不同浓度维生素E 对精子解冻后运动参数的影响 由表1 可知，当添加1% 维生素E 时，与对照组相比精子的TM 和PM 有一定的增加（>0.05）；当添加2% 维生素E 时，PM、TM、VCL、VAP、VSL均显著高于其他组；当维生素E 浓度升为4%和6%时，PM 和TM 逐渐下降，但较对照组仍有一定提高（>0.05）。

表1 稀释液中添加不同浓度维生素E 对驴精子冷冻解冻后运动参数的影响

2.2 在稀释液中添加不同浓度维生素E 对驴精子解冻后各功能参数的影响 由表2 可知，稀释液中添加维生素E 可降低驴冷冻解冻后精子的畸形率，提高了冷冻解冻后的顶体完整率、DNA 完整率、线粒体膜电位和钙离子含量，其中2%维生素E 组效果明显，与其他组差异性显著（<0.05）。但当维生素E 浓度继续增加时，畸形率开始升高，顶体完整率、DNA 完整率、线粒体膜电位、钙离子含量则开始出现下降趋势，但是与对照组相比仍有差异。在稀释液中添加不同浓度维生素E 时对冷冻解冻后精子质膜完整率的影响不显著。

表2 稀释液中添加不同浓度维生素E 对驴精子冷冻解冻后各功能参数的影响

2.3 驴冷冻精液输精后的妊娠结果 根据以上结果，分别用鲜精和添加2% 维生素E 组冷冻精液进行人工授精试验。鲜精组70 头母驴经同期发情处理后，在第12～16 天用超声波观察母驴卵泡发育情况。结果如表3所示，5 d 内发情母驴头数为60 头，发情率为85.7%。发情母驴按照设计方案进行人工授精，共输精60 头，在授精后15 d 用超声波检查妊娠状态，其中11 头妊娠，妊娠率为45%。冷冻精液组40 头母驴经同期发情处理后，在第12～16 天用超声波观察母驴卵泡发育情况，结果显示，5d 内发情母驴头数为32 头，发情率为80.0%。发情母驴按照设计方案进行人工授精，共输精32 头，在授精后15 天用超声波检查妊娠状态，其中11头妊娠，妊娠率为34.4%。结果显示，冷冻精液组受胎率较鲜精组相比差距不大。

表3 母驴同期发情和人工输精结果

3 讨 论

新鲜精液中富含丰富的抗氧化酶可以抵抗冷冻保存初期的氧化作用，但是随着保存时间的延长，这些抗氧化酶会逐渐失效，因此需要额外添加抗氧化剂缓解精子的过氧化，从而提高保存效果。本研究发现在冻精稀释液中添加不同浓度维生素E 能显著提高精子解冻后活力、线粒体膜电位、顶体完整率、DNA 完整率，降低畸形率，与对照组相比差异显著。随着维生素E 浓度的提高，精子运动参数逐渐升高后降低，添加2%维生素E 时效果最佳，表明维生素E 的添加对驴精液冷冻保存有一定保护作用。

维生素E 主要通过抗氧化作用提高精子的冷冻保存效果。精子质膜富含多不饱和脂肪酸，在精子冷冻过程中，精子本身和精清中产生的活性氧自由基被激活，与精子质膜上的多不饱和脂肪酸发生反应，使得膜上脂质的过氧化和脂肪酸双键丢失，膜完整性丧失、精子活力下降，最终导致精子畸形率上升，质膜完整率和顶体完整率下降。另外ROS 含量过高会造成精子DNA 双链断裂，DNA 出现碎片化，DNA 完整率降低。精子对低温比较敏感，冷冻过程中精子获能和运动时容易发生线粒体功能障碍，从而引起线粒体膜电位和钙离子含量的下降，供能（ATP）不足。上述精子功能指标均会影响精子质量，最终影响受胎率。维生素E 作为多酚类化合物，其分子中含有多个活性羟基和羧基，能提供氢自由基来有效消除ROS 和羟基自由基，从而避免发生氧化反应，有效减少精子的氧化损伤，维持精子结构和功能完整性；另一方面维生素E 的抗氧化性可能通过清除氢、氧自由基来实现。本研究结果显示，在冷冻稀释液中添加 2%的维生素E 可显著提高精子的各项运动和功能参数，表明维生素E 可能通过抑制氧自由基的形成阻止诱发膜脂质发生过氧化，从而对精子起到保护作用。另外本实验在精液稀释液中添加DMF 作为冷冻保护剂，DMF 是一种无色透明的液体，可作为抗冻保护剂用于精液冷冻保存。同时DMF 是一种低分子量化合物，可以更频繁地通过精子质膜，减少精子暴露于高渗环境的时间，从而减少氧化应激。

本实验中维生素E 对精子的冷冻保护效果并没随着添加浓度的增加而逐渐增强，浓度超过2%后，冻后精子各项检测指标均有所下降，这可能与过量添加维生素E 会降低冷冻稀释液的渗透性有关。当精液渗透压超过一定范围，精子会出现脱水、肿胀等现象，发生不同程度的损伤，细胞膜结构和顶体完整性等会遭到破坏，降低精液品质。本研究中，2%维生素E 添加对冷冻精子的保护效果最佳，可能同该添加浓度下精液渗透压最适宜相关，也说明研究精液冷冻保护剂时需要仔细考虑不同剂量对上述因素的影响。

4 结 论

本实验结果表明，在德州驴精液冷冻过程中，稀释液中添加维生素E 能有效提高冷冻解冻后的精子运动学参数，改善畸形率、质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位等功能参数，并且输精后可以获得理想的受胎率，其中维生素E 浓度2%为最佳，之后随着维生素E 浓度的提高，效果逐渐下降，但仍高于对照组。