山银花和姜黄提取物对蛋鸡输卵管组织形态、抗氧化指标和炎症因子的影响

葛 昕，王元智，龙美贞，董玉慧，吕慧源，袁建敏，周向梅*

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102206；3.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193)

近年来，随着育种水平不断提升，蛋鸡的产蛋性能逐渐提高，产蛋周期也逐渐延长，但生产中产蛋后期蛋壳品质越来越差，暗斑蛋越来越多等现象逐渐突出。研究表明，蛋壳品质取决于输卵管的结构和功能，由疾病或环境因素引起的输卵管氧化损伤或炎症是导致蛋壳品质变差的主要原因。

植物提取物由山银花提取物和姜黄提取物按一定的比例复配而成，主要成分是绿原酸和姜黄素。绿原酸和姜黄素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗过敏作用。研究发现，日粮中添加姜黄素可通过降低过氧化产物的堆积缓解免疫应激对仔猪肠道的损伤，从而提高仔猪肠道消化吸收的能力。饲料中添加姜黄素能够提高蛋鸡的生产性能，增加经济效益。但饲料中添加绿原酸和姜黄素是否可以缓解蛋鸡输卵管炎、改善蛋壳品质目前并不清楚。本试验通过在饲料中连续添加植物提取物，探求其对蛋鸡输卵管形态、抗氧化功能和炎症的影响，为提高蛋鸡后期蛋壳品质提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用的植物提取物由北京生泰尔科技股份有限公司提供，主要成分为山银花提取物和姜黄提取物，有效成分为绿原酸100 mg/kg、姜黄素20 mg/g。基础日粮和营养成分：表观代谢能10 883.2 KJ/kg，粗蛋白16.0%，赖氨酸0.76%，蛋氨酸+胱氨酸0.65%，钙3.9%，有效磷0.26%。

1.2 试验设计与饲养管理 选择400 日龄左右的蛋鸡约1 440 只，试验前鸡群整体质量良好，产蛋率不稳定。预饲期产蛋率在88.9%左右，随机分为4 个组，每组6 个重复，每个重复60 只鸡。采用单因子随机区组试验设计，设基础饲粮（不含植物提取物）（空白对照组）、植物提取物添加量分别为500、750 mg/kg 及1 000 mg/kg植物提取物处理组。预试期7 d，正试期42 d。

试验蛋鸡饲养在全封闭式的蛋鸡舍四阶梯式金属笼中间两层，鸡笼的每一层相连的15 个小笼作为1 个重复，各处理鸡重复间的排列考虑位置效应。机械通风，光照时间在16 h/d，舍内温度18～23℃，相对湿度为40%～60%。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 产蛋性能 试验进行过程中，每周测定蛋鸡产蛋量、平均蛋重和产蛋率。每天记录各个重复的鸡只死淘率、畸形蛋率、脏蛋率、软壳蛋率、水纹蛋率和破蛋率等（收集每个重复的全部鸡蛋）。

1.3.2 输卵管组织学观察 于正试期第42 天，每个重复随机取2 只蛋鸡进行剖杀，分离输卵管，按膨大部、峡部子宫部按东南西北区分别取样，样品1cm×1cm 置于10% 中性福尔马林固定24 h 以上，常规石蜡2 μm 切片，进行HE 染色和PAS 染色，光镜下观察。PAS 染色后的组织切片，每组选择3 只蛋鸡，每只蛋鸡选择3张非连续切片，每张切片选择10 个视野，在显微照相系统（Olympus，DP72，日本）下拍照，获得的照片在Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，美国）软件下对每100 个输卵管上皮细胞中糖原阳性的细胞进行统计。

1.3.3 输卵管组织抗氧化指标 于试验的第42 天，每个重复随机取2 只蛋鸡进行剖杀，分离输卵管，按膨大部、峡部子宫部按东南西北区分别取样，样品0.5 cm×0.5cm经液氮冷冻后-80℃中保存，用于测定蛋鸡输卵管组织中总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）含量。总抗氧化能力试剂盒、脂质氧化剂盒、总SOD 活性检测试剂盒、总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3.4 输卵管炎症因子mRNA 水平的测定

1.3.4.1 引物的设计与合成 根据GenBank 中公布的鸡，用Primer premiere 5.0 软件设计引物，采用Primer blast 工具进行检索来验证其特异性，引物序列见表1。

表1 Real-time 引物序列

1.3.4.2 RNA 的提取和cDNA 的合成 RNA 的提取根据艾德莱生物科技有限公司EASYspin Plus 组织/ 细胞 RNA 快速提取试剂盒，cDNA 的合成根据南京诺唯赞生物科技有限公司HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书。

1.3.4.3 Real-time PCR 用核酸测定仪测定cDNA 浓度，将cDNA 稀释成相同的浓度，作为real-time PCR 检测的模板。使用南京诺唯赞生物科技有限公司AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 进行q-PCR 反应。反应体系20 μL：cDNA 2 μL，SYBR Green Reaction Mix 10μL，dd HO 7.2 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL。IL-2、IL-4、IL-1、TNF-的反应程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；72℃30 s；40 个循环，设定收集荧光。IL-6、IL-10、-actin、IFN-的反应程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；40 个循环，设定收集荧光。以-actin 作为内参基因，2法计算目标基因的相对丰度。

1.4 统计分析 抗氧化指标和炎症因子含量使用GraphPad Prism8.0 软件进行分析，分析结果以平均值± 标准差表示，统计学差异使用Unpaired t-test 进行分析，“*”代表差异显著（<0.05）；“**”代表<0.01，“***”代表<0.001，差异极显著；“ns”代表差异不显著。

2 结果

2.1 植物提取物对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响 由表2可知，在1～6 周，添加500、750 mg/kg 及1 000 mg/kg植物提取物组的产蛋率较对照组分别提高2.88%、2.36%、3.39%（>0.05），平均蛋重略低于对照组（>0.05）。无壳蛋率方面，添加植物提取物组均低于对照组（<0.05）。750 mg/kg 植物提取物组的沙皮蛋率低于对照组，和500 mg/kg 组差异不显著。脏蛋率方面，添加植物提取物组均低于对照组（>0.05）。添加植物提取物组的日产蛋量均高于对照组（>0.05）。

表2 植物提取物对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响

2.2 输卵管组织学形态观察

2.1.1 HE 染色 HE 染色结果显示，对照组蛋鸡输卵管膨大部在低倍镜下可见黏膜上皮层和固有层分布大小不一、蓝染的炎性细胞浸润灶；添加植物提取物组黏膜上皮层和固有层结构完整，未见明显病变；高倍镜下可见对照组浸润的炎性灶主要由圆形、核质比高、嗜碱性蓝染的淋巴细胞构成。添加植物提取物组与对照组蛋鸡输卵管峡部组织学无明显差异。与对照组相比，添加植物提取物750 mg/kg 和1000 mg/kg 导致蛋鸡输卵管子宫部（东、南、西、北）固有层血管扩张淤血。

2.1.2 PAS 染色 PAS 染色结果显示，蛋鸡输卵管黏膜上皮层分泌细胞及固有层管状腺细胞内可见PAS 阳性信号，在高倍镜下可见均质、紫红色、圆形的糖原颗粒。输卵管不同部位阳性信号的强弱不同。对照组与添加植物提取物组膨大部黏膜上皮层及固有层均呈阳性；峡部黏膜上皮及固有层均呈强阳性；对照组子宫部东黏膜上皮呈阳性，添加植物提取物组子宫部东黏膜上皮均呈阴性；对照组与添加植物提取物组子宫部南黏膜上皮及固有层均呈阴性；与对照组相比，750 mg/kg 组子宫部西黏膜上皮呈阳性，其他添加植物提取物组均呈阴性；对照组与添加植物提取物组子宫部北黏膜上皮及固有层均呈阴性。与对照组相比，饲料中添加750 mg/kg 与1 000 mg/kg 植物提取物的蛋鸡输卵管峡部输卵管上皮糖原阳性细胞增加了23%（<0.01）。

2.2 饲料中添加植物提取物能提高蛋鸡输卵管抗氧化能力 由图4 可知，添加500 mg/kg 植物提取物能提高输卵管膨大部、峡部的T-AOC（<0.05 或<0.01），但对子宫部（东、南、西、北）的T-AOC 无显著影响；添加500 mg/kg 植物提取物能降低输卵管峡部的MDA含量（<0.01），对膨大部、子宫部（东、南、西、北）无显著影响；添加500 mg/kg 植物提取物提高输卵管膨大部、峡部的SOD 含量（<0.01），对膨大部、子宫部（东、南、西、北）无显著影响；添加500 mg/kg 植物提取物提高输卵管膨大部、峡部的GSH-Px 含量，对膨大部、子宫部（东、南、西、北）无显著影响。

图4 植物提取物对蛋鸡输卵管各部位抗氧化指标的影响

图1 植物提取物对蛋鸡输卵管各部位组织学形态的影响（HE 染色）

图2 植物提取物对蛋鸡输卵管各部位糖原阳性细胞的表达（PAS 染色）

图3 植物提取物对蛋鸡输卵管各部位糖原表达的影响

2.3 饲料中添加植物提取物显著降低蛋鸡输卵管细胞因子mRNA 水平 由图5 可知，添加500 mg/kg 植物提取物降低输卵管膨大部、峡部、子宫部（东、西）IL-4、IL-10、IL-2、IL-6、IFN-mRNA 水平的相 对表达量（<0.05 或<0.01），降低子宫部南IL-10、IL-2、IL-6、IFN-mRNA 水平的相对表达（<0.05或<0.01），子宫部北与对照组差异不显著；添加500 mg/kg 植物提取物降低输卵管膨大部IL-1mRNA 水平的相对表达（<0.01），提高子宫部西IL-1mRNA 水平的相对表达（<0.01），峡部、子宫部（东、南、北）与对照组差异不显著；添加500 mg/kg 植物提取物降低输卵管膨大部、峡部、子宫部（东、南、西、北）TNF-mRNA 水平的相对表达（<0.01）。

图5 植物提取物对蛋鸡输卵管各部位细胞因子mRNA 水平的影响

3 讨 论

3.1 饲料中添加植物提取物对蛋鸡生产性能的影响 植物提取物的有效成分绿原酸和姜黄素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化、抗过敏以及免疫调节的作用，这些作用有助于维持机体的抗氧化还原平衡以及肠道菌群的稳态，减少环境应激，从而提高动物的生产性能。黄涛等研究表明，日粮中添加绿原酸可改善肉鸡生产性能，提高肉鸡血清免疫指标及肉品质。本试验结果表明，饲料中添加500 mg/kg 的植物提取物能明显提高蛋鸡后期产蛋率、产蛋量、平均蛋重以及改善蛋壳品质，这种改善作用可能是通过、减轻输卵管膨大部组织学结构，增强输卵管上皮细胞的糖原合成和贮存功能来实现的。

3.2 饲料中添加植物提取物对蛋鸡输卵管组织学形态的影响 输卵管炎是蛋鸡养殖中的一种常见病，多发于初产鸡和高产鸡，常见病原菌是沙门氏菌和大肠杆菌，临床症状表现为出血性输卵管炎、产蛋异常、卵巢炎和腹膜炎，造成产蛋减少，严重者可引起蛋鸡死亡。Varmuzova 等研究表明，在饲料中添加姜黄和黄芩提取物可有效降低由热或肠炎沙门菌鸡的肠道炎症，减少盲肠中肠炎链球菌数量，提高生产性能。本试验结果表明，饲料中添加植物提取物能减少蛋鸡输卵管膨大部的炎性灶，并显著提高输卵管峡部的糖原合成和贮存功能。因此，植物提取物可能有利于产蛋后期蛋鸡输卵管炎的防控。

3.3 饲料中添加植物提取物对蛋鸡输卵管各部位抗氧化能力的影响 氧自由基是机体正常代谢时产生的有极强氧化能力的活性原子或基团。机体不正常的代谢会产生大量的氧自由基，过量自由基会对动物造成氧化应激，氧自由基攻击膜结构会使细胞组织结构和功能均遭到破坏。饲料中添加绿原酸能改善断奶仔猪机体清除自由基能力，保护了细胞膜的完整性，增加机体抗氧化的能力，促进养分的吸收和利用。

本试验中，在基础日粮中添加植物提取物可有效提高蛋鸡输卵管膨大部和峡部T-AOC、SOD 和GSH-Px水平，显著降低MDA 的含量，从而提高机体抗氧化能力。这与在母猪、肉鸡、大鼠上的研究一致。本试验结果表明，植物提取物可以通过增强机体抗氧化物酶活性、抑制机体氧化酶活性来缓解氧化应激，使动物机体的抗氧化能力得到提升。

3.4 饲料中添加植物提取物对蛋鸡输卵管各部位细胞因子mRNA 表达的影响 Zhang 等首次证明，绿原酸能通过抑制促炎细胞因子IFN-、IFN-、IL-1、IL-17A、IL-22 和TNF-的mRNA 表达减轻感染A 型产气荚膜梭菌的鸡回肠炎症反应，抑制小肠结构损伤，有效改善感染鸡的生长性能。

本试验结果表明，饲料中添加植物提取物能显著降低输卵管膨大部、峡部、子宫部促炎细胞因子IL-2、IL-1、IL-6、TNF-、IFN-mRNA 表达水平，同时抑炎因子IL-4、IL-10 mRNA 水平显著降低。在正常情况下，机体炎症因子的表达处于平衡状态，当机体受到病原体的入侵时，促炎因子的表达相对提高而抑炎因子的表达相对降低，使机体处于免疫应答状态。金银花属于清热解毒药物，其发挥抗炎作用的机制是抑制炎症相关因子的表达或产生。本试验选择产蛋后期的蛋鸡为研究对象，饲料中添加植物提取物后使输卵管促炎因子水平降低，机体为了维持相对平衡状态，抑炎因子的水平也相应降低。其中，膨大部和峡部细胞因子mRNA水平的表达下降倍数均高于子宫部，说明植物提取物对蛋鸡输卵管膨大部和峡部的炎症改善作用更显著。

4 结 论

在本试验条件下，基础饲料中添加植物提取物可以改善蛋品质，降低无壳蛋率，其中500 mg/kg 添加量性价比最优。除生产性能外，基础饲料中添加植物提取物能减轻蛋鸡输卵管组织学病变，提高蛋鸡输卵管抗氧化能力以及降低蛋鸡输卵管炎症因子的表达，其中对蛋鸡输卵管膨大部和峡部炎症改善作用更显著。因此，饲料中添加植物提取物可能通过提高输卵管抗氧化能力和降低炎症因子的表达，改善蛋鸡产蛋后期蛋品质。