表皮生长因子受体靶向药物在肝细胞癌中作用机制的研究进展

贾谷和，邵佳康，赵 晓，郑宏烨，秦博宇，李 珂，孙小惠，周宇欣，张 正，焦顺昌

1 南开大学医学院，天津 300071；2 解放军总医院第一医学中心 肿瘤内科，北京 100853；3 解放军医学院，北京 100853

在全球范围内，原发性肝癌(primary hepatic cancer，PHC)的发病率在所有恶性肿瘤中居第6位，死亡率居第2位。在死亡率排名前5的癌症中，PHC是唯一一种发病率和死亡率都呈上升趋势的癌种，其全球年发病率约9.3/100 000，相应的死亡率约8.5/100 000[1]。在中国，约90%的PHC为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其发病率在所有肿瘤中居第5，死亡率居第2，患者5年生存率仅12.1%[2]。不仅如此，50%的HCC患者在初次诊断时即为晚期，而全身系统治疗是此类患者的唯一选择[3]。目前，对于早期HCC患者，手术切除、射频消融和肝移植是HCC有效的治疗方法，但即使进行根治性切除，60% ~ 70%的患者在5年内仍有较高复发或转移的风险[4]。近年来，美国食品和药物管理局(U.S. Food and Drug Administration，FDA)批准多激酶抑制剂索拉非尼和仑伐替尼为晚期HCC的一线疗法[5]，该类靶向药物除缩瘤率较低外，还具有较强的不良反应，包括疲劳、体质量减轻、腹泻和皮疹等，这限制了其在部分患者中的应用[6]。然而，HCC的主要突变靶点如TP53、CTNNB1 和 TERT启动子等缺乏成药性，无法作为有效的药物治疗靶点。据报道，40% ~ 70%的HCC患者表现出表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)过表达和EGFR基因拷贝数扩增现象[7]，且市面上已经有成熟的EGFR靶向药物，并在其他高表达EGFR的癌种中有较好的疗效[8]。EGFR靶向药物主要有以西妥昔单抗(cetuximab)为代表的单克隆抗体和以阿法替尼(afatinib)为代表的酪氨酸激酶抑制剂，这些药物在临床上可有效抑制肿瘤细胞增殖，对部分晚期HCC患者产生积极效果。因此，探究EGFR靶向药物在HCC中的作用机制，也许可为HCC的临床治疗提供理论支撑。

1 EGFR的分子结构

ERBB受体酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinase，RTK)由EGFR(也称为ERBB1、HER1)、HER2(ERBB2、HER2)、HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4)组成，EGFR由1 186个氨基酸残基构成，相对分子质量约为170 kU，主要位于细胞膜表面，在该家族中最具代表性[9]。EGFR胞外配体结构域由高度糖基化的622个氨基酸组成，包含两个富含半胱氨酸的区域，负责与配体结合向下传递信号；跨膜结构域是包括23个残基的α-螺旋结构；胞质内结构域包含一由250个氨基酸组成的保守蛋白酪氨酸激酶核心，以及一个由229个氨基酸构成的带有调节性酪氨酸残基的C-末端调节域[10]。当配体如表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)或肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等与受体结合后，EGFR激酶结构域改变并形成同源或异二聚体。SHC(shell script compiler)被EGFR二聚体磷酸化后，能够与Sos(son of sevenless)和生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)结合，形成大型信号复合物，与下游Ras、PI3K、PLC、JAK等信号蛋白相互作用。随后激活各种信号通路，并最终刺激HCC细胞增殖[11]。

2 EGFR在HCC细胞中的下游通路

EGFR在HCC细胞主要有以下通路：1) EGFR激活Ras/MEK/ERK通路；2) EGFR激活JAK/STAT通路；3) EGFR激活PI3K/AKT/mTOR通路；4)其他通路。EGFR通过以上通路影响HCC细胞的增殖。如图1。

图1 EGFR在HCC细胞中的作用机制Fig.1 The Mechanism of EGFR in HCC

2.1EGFR激 活Ras/MEK/ERK通 路 以 及 阿 法 替尼和吉非替尼在该通路的机制 活化的EGFR磷酸化激活Ras，介导Raf激活。Raf磷酸化并激活MEK，从而激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)。活 化 的ERK使RSK磷酸化，RSK在细胞核中刺激转录因子Elk-1等表达，促进肿瘤细胞增长和转移[12]。

Yang和Liu[13]发现在HCC细胞组织中，ERK的表达水平在肿瘤组织中明显高于正常肝组织，与肿瘤大小呈正相关。在肿瘤细胞中磷酸化的ERK(即p-ERK)异常升高，53%的HCC组织中p-ERK的表达高于癌旁组织。Chen等[14]通过对HCC细胞Huh-7的研究，发现阿法替尼(Afatinib)可以通过抑制EGFR的磷酸化，降低ERK信号通路磷酸化的水平，同时可以抑制上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)这 一 过程，降低MMPS的表达水平。而研究表明MMPS能够切割位于细胞膜上的EGFR配体，如EGF等，刺激配体脱落到细胞外空间，重新与细胞膜上其他EGFR分子结合，刺激受体的二聚化和激活，从而导致信号级联的激活[15]。Jin等[16]在体外实验中发现吉非替尼联合仑伐替尼对表达EGFR的HCC细胞株有强大的抗增殖作用。仑伐替尼在发挥抗肿瘤血管生成作用时，反馈激活EGFR导致其下游信号通路PAK/MEK1/2/ERK1/2激活，促进HCC细胞增殖，限制了药物反应，但联合用药可以使该通路因EGFR被抑制而阻断，提高该药物对肿瘤的治疗效果。同时，在实验末期，肿瘤细胞中可以观察到NK细胞和CD8+T细胞进一步浸润，这种免疫重塑为进一步提高联合治疗的效果提供了可能性。

从上述研究不难看出，抑制EGFR可以降低Ras/MEK/ERK通路下游因子的磷酸化水平，抑制细胞核中转录因子的表达，抑制HCC细胞的增殖。同时通过降低MMPS表达水平和抑制EMT转化，进一步抑制EGFR的作用和HCC细胞的侵袭迁移能力，从而抑制HCC细胞的增殖。不仅如此，EGFR抑制剂与其他药物的联用也可以进一步阻止其因激活旁路产生的耐药问题，进一步提高药物对HCC细胞的治疗效果。

2.2EGFR激活JAK/STAT通路及西妥昔单抗和厄洛替尼在该通路的机制 活化的EGFR通过磷酸化JAK最大程度激活信号传导及转录激活因子1/3(signal transducers and activators of transcription 1/3，STAT1/3)，或者结合并磷酸化STAT直接激活STAT1后再激活STAT3，磷酸化STAT1/3形成p-STAT1/3，随后STATs发生二聚化并转移到细胞核，在核内激活CCND1和BIRC5等基因的转录，改变细胞周期进程，参与HCC细胞的增殖、分化和存活[17]。

Xue等[18]研究发现西妥昔单抗降低HCC细胞中EGFR的表达和STAT3的磷酸化水平，但对抑制HCC细胞增殖的作用有限。然而STAT抑制剂仅增加了上皮表型HCC细胞(Huh7、Hep3B和HepG2)对药物的敏感度，对具有间充质表型的HCC细胞(SNU449和SNU387)没有影响，因此西妥昔单抗联合STAT抑制剂时，可以增强对上皮型HCC细胞的杀伤作用。Zhang等[19]在高表达EGFR的HCC细胞HepG2的实验中发现，当使用厄洛替尼联合EGFR激动剂时，较单用厄洛替尼，EGFR被进一步激活，p-STAT增多，通过JAK-STAT通路被进一步激活。当时联用EGFR抑制剂时，p-STAT减少，同时使HCC细胞增殖受到抑制。

在关于西妥昔单抗的研究中不难发现，其单独使用在临床试验中只有轻微的效果，耐药性可能是一个重要原因。西妥昔单抗可以与STAT抑制剂联用，增强对上皮型HCC细胞的杀伤作用，但对间充质表型细胞作用有限。因此，厄洛替尼联合其他药物可以增强对HCC细胞的抑制作用，联合其他药物提高西妥昔单抗在HCC治疗中的敏感度可能获得理想的疗效。

2.3EGFR激 活PI3K/AKT/mTOR通 路 及 尼 妥 珠单抗和厄洛替尼在该通路的机制 活化的EGFR可以通过直接活化Ras间接激活PI3K，PI3K通过磷酸化PIP2催化PIP3的产生。PIP3可以通过磷酸化PDK1后激活蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)，最后激活mTOR，增加蛋白质翻译，从而保护细胞免于细胞凋亡[20]。

Wang等[21]比较了敏感组(PLC/PRF/5和Hep 3B2.1-7)和耐药组(LI-7、SK-Hep-1、SNU-182和SNU-387)细胞系之间的RNA-seq差异发现，针对尼妥珠单抗耐药和敏感两组肿瘤细胞的基因在EGFR通路中表达无明显差异，似乎与Hoshida亚类(S1、S2和S3)有关。3个ECM基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)和MMP9是与耐药性相关的聚集区。敏感组细胞株均高表达S2和S3基因，其与HCC细胞分化、细胞增殖和AKT活化相关。耐药株S1基因高表达，S1反映WNT信号通路的异常激活，该通路与EMT转化相关。Park等[22]在研究中发现，ECM基因可以在外界刺激下触发EMT过程，因此ECM基因是启动EMT的关键基因。Xu等[23]发现通过抑制HepG2细胞中EGFR的活化，抑制了AKT的磷酸化，可以下调MMPS的表达，抑制EMT，降低其迁移和侵袭能力。Wang等[24]研究了弹力素和EGFR抑制剂在HCC进展中的作用，发现弹力素通过磷酸化AKT独立地促进HCC转移。因此可以将抗弹力素和厄洛替尼组成的联合疗法应用于HCC的治疗。Li等[25]研究发现药物诱导自噬可能在肿瘤细胞的自我保护反应中发挥作用，厄洛替尼的作用可能会增强这一反应，使得其对HCC细胞的杀伤力减低。P57作为一种细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent protein kinases，CDK)抑制剂，在上皮表型HCC细胞(MHCC97L、Hep3B和HepG2)中可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，使其磷酸化水平增高，抑制厄洛替尼诱导的自噬，从而提高治疗效率。

我们可以发现，EGFR抑制剂单药对于抑制HCC细胞的作用不强。在针对其敏感株和耐药株的对比中发现，HCC细胞对EGFR抑制剂的耐药性可能与AKT激活、MMP的表达及EMT转化有关，而且与其他药物联用可以增加EGFR抑制剂的作用，如抑制HCC细胞的自噬，均可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，提高药物的治疗效果。

2.4其他通路及吉非替尼在该通路的作用机制活化EGFR激活PLC-γ1催化PtdIns-4,5-P2，产生IP3和DAG，调节多种细胞功能，包括细胞增殖、分化、受体内吞、细胞运动和癌细胞侵袭[15]。在EGFR抑制剂作用于HCC细胞的机制研究中，对这一通路的研究较少，可能是药物对这一通路的影响较小。

EGFR与其配体结合后可以入核，与PARP相互作用并且诱导PARP磷酸化，同7细胞增殖等有关[15]。Dong等[26]在上皮表型且高表达EGFR和HGF的(Ton/HCC、SK-Hep1和Hep3B)HCC细胞中发现，HGF保持定位于细胞核中，EGFR受到刺激信号后易位至细胞核中，与HGF可以形成异二聚体，与PARP相互作用并且诱导PARP磷酸化，影响HCC细胞的增殖。因此，吉非替尼联合抑制HGF及PARP可能对HCC细胞有更强的杀伤作用。对于肿瘤同时表达EGFR和HGF的HCC患者，可能需要 3 种药物的组合，以实现对高表达EGFR和HGF患者较好的治疗效果。

3 EGFR在HCC细胞中的耐药机制

研究发现，HCC对于EGFR靶向药物的主要耐药机制有以下三点。1)EGFR的突变：多见于19外显子的缺失、20外显子插入突变和21外显子L858R突变，这些突变可以通过更换有效的EGFR-TKI药物取得较好的疗效，但对于HCC，这方面的研究还有所欠缺。2)多旁路通道激活：Ribback等[27]在小鼠的模型研究发现吉非替尼使HCC细胞癌前病变的数量和增殖活性都减少，抑制EGFR可减少癌前病变向HCC的进展，但对HCC的增长抑制作用有限。这表明EGFR信号通路在HCC发生的后期阶段只有部分相关性，已知有多条致癌途径被激活，应考虑与传统的细胞抑制药物或其他靶向药物联合治疗。3)表型转化：在其他癌肿中，EMT转化是一种重要耐药机制[28]，在HCC中结合上述研究，EGFR、ERK、MMPS三者之间可能存在环形通路，该通路可能与HGF的转化相关。EGFR抑制剂可能影响HGF转化，使HCC细胞由上皮表型转化为间充质表型，改变细胞黏附性，刺激细胞运动和侵袭，产生耐药机制。

4 结语与展望

本文对EGFR靶向药物治疗晚期HCC的作用机制和耐药机制进行了全面总结。总而言之，目前治疗HCC的一线靶向药物有多激酶抑制剂索拉非尼和仑伐替尼，其中索拉非尼的总生存期(overall survival，OS)为12.3个月，无进展生存期(progression-free survival，PFS)为8.9个月，仑伐替尼的OS为13.6个月，PFS为3.7个月，仍有复发率高、预后差、不良反应多等缺点[29]。EGFR抑制剂在HCC的临床应用中极具研究潜力。阿法替尼可通过降低p-ERK抑制EGFR磷酸化的水平，同时抑制EMT并降低MMP9的表达水平。西妥昔单抗可以与STAT抑制剂联用，但仅对上皮型HCC细胞表现出较强的杀伤作用。尼妥珠单抗对HCC细胞的抑制作用并非依赖于EGFR的高表达，可能与3个ECM基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)和MMP9相关，ECM基因可启动EMT，MMPs可以进一步激活EGFR通路，同时HCC细胞的侵袭性与p-ERK水平呈正相关，因此尼妥珠单抗的耐药性和敏感度可能与细胞的EMT和侵袭迁移能力有关，该联系可能为我们进一步的治疗提供新的研究方向。厄洛替尼与其他药物联用也可以提高对HCC的治疗效率。吉非替尼与抗血管药物联用或与PARP抑制剂和HGF抑制剂的联用都可以对HCC患者有较好的效果。而在厄洛替尼和索拉非尼联合应用的Ⅲ期试验中，发现对索拉非尼耐药的患者不会从厄洛替尼的治疗中得到任何临床获益[30]，通过对其机制的研究发现Elafin可以通过磷酸化AKT独立促进HCC转移，未进行优势人群的筛选、两药联合药物毒性不良反应叠加、因毒性不良反应导致实际完成治疗周期不足等原因使该III期试验未取得理想效果。尽管未能取得理想疗效，但其作为一种潜在的治疗选择不应该被放弃，值得进行进一步评估和研究。

目前EGFR抑制剂在HCC中作用机制的研究相对较少，在临床应用中的疗效不甚理想，且目前开展的相关研究仅针对不可手术的晚期HCC患者，而缺少对手术后复发转移患者的用药研究，因此需要大量全面的临床试验来证实其临床的指导意义和实用价值。继续研究EGFR靶向药物在HCC细胞中的作用机制和耐药机制，进一步探索其在HCC细胞中是否存在新的通路，或许能够解释其在临床实验中未能取得较好疗效的原因，并且通过对作用机制的深入了解，可以选择合适的药物联合方案，制定更加安全有效的治疗方法指导临床治疗。同时可以对人群采用更高特异性和敏感度的预测指标进行检查和筛选，选择对EGFR靶向药物敏感的优势人群，提高EGFR抑制剂对HCC患者的疗效，延长HCC患者的寿命，提高患者的生存质量。