抗酸分枝杆菌荧光染色与Ziehl-Neelsen法在抗酸分枝杆菌检测中的应用比较

彭 凤，何 金，李琼琼，蒋立人，师晓琴，林 军

2019年全球约1 000万人罹患结核病，其中中国患者占全球感染总人数的8.4%[1]。2020年全球结核病报告指出结核病最常见死因是由单一传染源导致的[2]，结核分枝杆菌是常见的感染菌之一，可感染全身各器官，其中以肺部最易感染[3-4]。早期诊断对治疗和阻断结核分枝杆菌传播具有重要意义。目前，检测结核分枝杆菌最常用的方法是Ziehl-Neelsen法，但其对处于潜伏期的结核分枝杆菌检出率较低[5-6]。此外，培养法也是一种较为常用的检测方法，但通常需要2～8周时间，耗时较长[7]。PCR技术可扩增结核分枝杆菌DNA[8]，但不能区分活菌和死菌以及菌体形态[9-10]，有假阳性的可能[11]。本科室使用抗酸分枝杆菌荧光染色检测抗酸分枝杆菌，可缩短检测时间，提高效率，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2020年1月～2021年6月上海市第一人民医院存档的91例肉芽肿性病变的常规石蜡标本以及576例体液标本，包括肺泡灌洗液、尿液、胸水、痰等。从91例患者石蜡标本中各采集3个样本，分别行抗酸染色、抗酸分枝杆菌荧光染色和HE染色。

1.2 标本处理人体组织离体后，经10%中性福尔马林固定6～48 h，脱水，浸蜡，制成组织蜡块。组织切片经70 ℃烤片2 h后，再放入二甲苯中脱蜡15 min×2次，经过100%、95%、70%梯度乙醇脱水，放入自来水中备用。体液样本处理方法：将肺泡灌洗液、尿液、胸水等样本倒入50 mL离心管中，2 200 r/min离心5min，去上清后加入10%中性福尔马林中固定2 h；痰液中加入溶痰试剂，加入10%中性福尔马林固定2 h。2 200 r/min离心5 min，去上清后加入细胞清洗液清洗，离心后取沉淀物涂片，55 ℃烤15 min待用。

1.3 Ziehl-Neelsen法Ziehl-Neelsen法用于标识抗酸分枝杆菌，购自珠海贝索公司。切片脱蜡后，控干，用流水冲洗，滴加石碳酸复红染液于切片上，室温染色10～15 min，水洗，控干，滴加酸性乙醇脱色1～2 min，重复至红色消失，水洗，加亚甲基蓝溶液20～30 s，水洗。滤纸吸干水分，中性树胶封固。

1.4 抗酸分枝杆菌荧光染色抗酸分枝杆菌荧光染色液，购自江苏供赢联生物公司，抗酸分枝杆菌荧光染色试剂(无苯酚)主要成分由媒染剂、荧光素、盐酸、乙醇、复染剂、纯水及其他等组成。准备涂片或石蜡组织切片，水洗后控干待检；加2滴荧光染色液(A液)，覆盖样本，室温染色15 min，流水冲洗，再滴加脱色液(B液)1～3 min，水洗，直至肉眼观察无染料颜色，在荧光显微镜下观察，无杂质或坏死部位着色，晾干后用中性树胶封固，荧光显微镜下观察。

1.5 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，检测结果一致性分析采用K系数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

91例伴肉芽肿性病变的石蜡包埋组织，分别用抗酸分枝杆菌荧光染色和Ziehl-Neelsen法进行抗酸分枝杆菌检测。经两位病理医师阅片后，Ziehl-Neelsen法检测14例阳性，77例阴性。抗酸分枝杆菌荧光染色检测27例阳性，64例阴性。抗酸分枝杆菌荧光染色法阳性率(29.67%)高于Ziehl-Neelsen法(15.38%)(表1)。

表1 不同方法检测抗酸分枝杆菌的比较

在91例伴肉芽肿性病变中，有75例t-spot阴性，采用抗酸分枝杆菌荧光染色重新检测，75例中有10例阳性，占13.33%。其原因可能是由于检出物为非结核性抗酸，或是疾病处于潜伏期，t-spot未能有效检测。Ziehl-Neelsen法检测77例阴性，采用抗酸分枝杆菌荧光染色重新检测，17例阳性，占22.07%。其原因之一是由于患者服用药物破坏了抗酸分枝杆菌的抗酸性，Ziehl-Neelsen法未能检出，但荧光染色仍存在，用荧光染色可检出阳性，表明抗酸分枝杆菌荧光染色更灵敏。

在576例体液样本中，抗酸分枝杆菌荧光染色检测抗酸分枝杆菌的阳性率为10.94%。按照阳性率高低排序分别为：灌洗液(13.21%)>痰(9.86%)>胸水(4.16%)>尿液(0)(表2)。

表2 抗酸分枝杆菌荧光染色检测体液样本的阳性率

肺组织的Ziehl-Neelsen抗酸染色，抗酸分枝杆菌呈粉色杆状(图1)；而荧光染色后呈亮黄色杆状，更易于识别(图2)；支气管活检组织抗酸分枝杆菌荧光染色呈强阳性(图3)。另外，对体液样本进行荧光染色呈阳性，如肺泡灌洗液、痰、胸水(图4～6)。

图1 肺组织抗酸分枝杆菌检测：呈粉色杆状，Ziehl-Neelsen染色法 图2 肺组织抗酸分枝杆菌检测：呈亮黄色杆状，荧光染色 图3 支气管活检组织抗酸分枝杆菌检测：呈亮黄色杆状，荧光染色 图4 痰液抗酸分枝杆菌检测：呈亮黄色杆状，荧光染色 图5 肺泡灌洗液抗酸分枝杆菌检测：呈亮黄色杆状，荧光染色 图6 胸水抗酸分枝杆菌检测：呈亮黄色杆状，荧光染色

3 讨论

Ziehl-Neelsen法是检测抗酸分枝杆菌最常用的方法，可用于痰涂片和组织切片染色，其缺点是敏感性低，总阳性率不高，但操作简单方便。目前，Ziehl-Neelsen法仍是国内大多数医院，用于检测体液或组织样本中抗酸分枝杆菌的主要方法。

本实验对比抗酸分枝杆菌荧光染色和Ziehl-Neelsen法对抗酸分枝杆菌的诊断效能，结果显示：抗酸分枝杆菌荧光染色阳性率高于Ziehl-Neelsen法，分析其原因在于抗酸分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖外，导致Ziehl-Neelsen法检测不易着色，而经过荧光染色后，荧光素与样本中抗酸分枝杆菌细胞壁相应抗原结合后，在荧光显微镜激发光下呈特异性荧光成像，呈亮黄色，色差明显，便于识别。Ziehl-Neelsen法检测操作简单方便，价格优惠，但受标本质量、实验条件以及温度等影响较大，对相同样本检出的阳性率比荧光染色低1.93倍，有一定程度的不足。

另外，对于t-spot检测为阴性的样本，重新用抗酸分枝杆菌荧光染色检测，筛选出部分遗漏的抗酸分枝杆菌阳性样本。本组还对Ziehl-Neelsen法检测为阴性的样本，应用抗酸分枝杆菌荧光染色重新检测，筛出部分遗漏的阳性样本。上述结果表明抗酸分枝杆菌荧光染色可在一定程度上降低漏诊率，弥补Ziehl-Neelsen法的缺陷，提高准确率。还可对体液样本进行检测，如：肺泡灌洗液、尿液、胸水、痰等。体液组织比石蜡组织切片更易获取，且可以多次、分时段获取。576例体液样本中抗酸分枝杆菌的阳性率为10.94%。

本实验中抗酸分枝杆菌荧光染色比Ziehl-Neelsen法的抗酸分枝杆菌检出率高1.93倍，抗酸分枝杆菌荧光染色在低倍镜下可观察菌体呈亮黄色，背景黑暗，具有清晰的形态特征，易于检测。Ziehl-Neelsen法需先用40×物镜观察，再用100×油镜观察形态，每个标本需观察300个以上视野，易漏检。荧光染色法在含菌量低时能够显著提高阳性的检出率，降低漏诊率，结果判读快速准确，可节省时间和精力。因此，抗酸分枝杆菌荧光染色具有更高的临床应用价值，更适用于基层医院推广使用。

综上所述，抗酸分枝杆菌荧光染色在辅助诊断结核患者中具有较高的效能和应用价值，但对于小部分较难判断或有其他未知影响因素的患者需配合其他辅助诊断，以增加结核患者诊断的准确性和可靠性。