基于HPLC指纹图谱技术的烤烟质量分类研究

董世良，詹斯文，何结望，邱 彤，张雪琼，刘峰峰

（1湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430048；2武汉理工大学化学化工与生命科学学院，武汉 430070）

0 引言

烟草为茄科烟草属植物的全草，作为一种农作物，具有较高的经济价值。它化学成分复杂，目前检测到的化学成分就有4000余种[1]，各化学成分的含量与多种因素有关，包括产地、气候、加工工艺等。烟草化学成分是影响烟叶品质的内在因素[2]。如何通过可检测的化学成分含量来全面整体地反映烤烟的质量是目前研究的难点。目前，烤烟品质大多是通过烟叶中的单项或常规化学成分含量来评判[3-5]，评价结果比较片面仅能起到烟叶评价的辅助作用。例如，钾氯比仅能表明烟叶的燃烧性，施木克值仅能描述烤烟和香料烟的吃味品质，糖酸比仅能反映烤烟的香气风格和香气品质，氮碱比反映烟气的浓度、吃味，糖碱比只能用来判断烟气的柔和性和香味[6-7]等。

指纹图谱技术是从物质所含有的特性成分出发，运用光谱、色谱、核磁、X射线、电化学、质谱等现代分析技术，得到能够表征药材或中药产品特性的谱图[8]。在中药评价中应用颇多[9-11]，在烟叶品质鉴别中属于比较新的一类技术。目前指纹图谱技术在烟草行业的应用主要集中在烟用香精的质量控制上，运用指纹图谱技术对烤烟品质进行评价的报道较少。

指纹图谱的基本属性是整体性和模糊性[12]。模糊性强调的是对照样品与待测样品指纹图谱的相似性，而不是完全相同；整体性是强调完整地比较色谱的特征“面貌”，而不是将其“肢解”。烤烟烟叶的指纹图谱将烤烟作为一个整体进行分析，对烤烟内部的多种化学成分进行整体的把控，相比于传统的评判烤烟质量的方法，是通过多种成分对烤烟质量进行评价，对比单项化学指标评价更具可靠性。

刘伟等[13]为优化烟叶原料感官质量的评价方法，运用系统聚类和Fisher线性判别法，建立基于化学成分的烤烟感官质量特征分类评价方法，结果表明，聚类分析可将陕西中烟曲靖沾益基地县烟叶的感官质量特征合理分类。杨明峰等[14]根据烤烟外观关键指标，采集了全国112个典型生态点初烤C3F烟叶样品，运用快速聚类法(K-means cluster)分析了各烟草种植区烤烟外观质量区域特征及分布，结果表明5个烟草种植区中部烤烟外观质量均可分为3类。上述研究均需依靠主观经验，首先将烤烟外观、感官指标进行打分，样品量大时耗费人力物力，且存在主观偶然性。为解决此问题，本研究依托高效液相色谱法，结合主成分及聚类分析对烤烟质量进行分类，拟解决当前烤烟质量分类费时费力且主观偶然性强的问题。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟叶包含多个品种，14批烟叶分别为10批‘云烟87’、2批‘K326’、1批‘龙江911’、1批‘红大’，等级为B2F下限，2019年及2020年分别取自全国多个省份14个不同的烟叶产区，包括湖北襄阳保康、湖北恩施宣恩、湖北十堰房县、湖北保康、湖北咸丰、安徽皖南宣城、福建龙岩、湖南永州、黑龙江林口、河南驻马店、云南马龙、云南沾益、四川凉山会东、贵州威宁。所有烟样在2019—2020年采样收集后，经湖北中烟工业有限公司统一复烤后制成烤烟。

1.2 指纹图谱数据库的建立

1.2.1 供试品溶液的制备 烟叶粉碎成细粉，精密称取0.1 g，置于50 mL锥形瓶中，精密加入20.0 mL 50%甲醇+水溶液，置于温度25℃、频率为40 MHz的超声波仪器中超声波振荡器超声提取20 min。取约2 mL萃取液经0.45µm的水相滤膜过滤。

1.2.2 对照品溶液的制备 配制绿原酸、莨菪亭、芦丁、山萘酚对照品的混合溶液。

1.2.3 液相条件 色谱柱为Agilent ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相 A 为水:甲醇:乙酸=88:10:2（体积比），流动相B为水:甲醇:乙酸=10:88:2（体积比）。梯度洗脱程序：0 min，A与B体积比为100:0，16.5 min体积比80:20，30 min体积比20:80，柱温30℃，流速1 mL/min，进样量10µL，检测波长340 nm，参比波长480 nm。

测试完得到的液相指纹图谱用2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行处理，峰匹配后生成对照图谱，得到14批烤烟的高效液相指纹图谱库。

1.3 化学测定方法及数据统计分析

烟碱、总氮、总糖、还原糖、钾、氯等常规化学成分分别参考 YC/T 468—2013、YC/T 161—2002、YC/T 159—2002、YC/T 217—2007、YC/T 162—2002、YC/T216—2013测定。应用SPSS 26.0软件进行主成分分析、简单相关分析、复相关分析，用类平均法进行聚类分析。采用Excel 2003软件进行做图分析。用2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版对指纹图谱进行相似度评价。

2 结果与分析

2.1 烟叶指纹图谱及其主成分分析

2.1.1 指纹图谱共有模式的建立 选取不同产地的B2F下限烟叶样品共14批，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版），选择样品峰较为明显、形状较为规整的样品图谱作为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，选用平均数法生成对照图谱，多点校正后选取峰占比在0以上的峰进行匹配与识别，得到指纹图谱共有模式图谱，确定了16个共有峰。通过与混合对照品色谱图（图1）和液质联用图谱对比，指认了其中4个色谱峰，分别为4号峰（17.94 min，绿原酸）、10号峰（26.42 min，东莨菪内酯）、12号峰（35.60 min，芦丁）、14号峰（38.45 min，山奈酚）。14批烟叶样品的叠加指纹图谱及对照指纹图谱如图2～3所示，其中R为峰匹配后建立的对照图谱。

图1 混合对照品溶液色谱图

图2 14批烟叶样品的HPLC叠加指纹图谱

图3 烟叶样品的HPLC对照指纹图谱

由图2可以看出，指纹图谱中主要峰群的整体面貌基本一致，但其中不同成分量的相对值有所不同，表明烟叶样品的质量受多种化学成分含量的影响，烤烟质量评价要结合多种化学成分含量综合考虑。

2.1.2 相似度分析 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版），以每批样品生成的对照图谱为对照，计算14批样品的相似度。结果（表1）表明，14批样品的相似度较高，样品相似度计算结果都在0.950以上，说明各批烟叶单独比对时不同烟叶产区样品之间的多酚成分差异不大。

表1 14批烤烟样品及对照图谱的相似度评价结果

2.1.3 指纹图谱主成分分析 主成分分析是最常用的多指标线性降维压缩和多变量分析方法。它可将众多具有一定相关性的原始变量，重新组合成为一组新的、相互无关的综合指标来代替原有的变量，从而实现以最少的主成分尽可能多地体现原始变量的信息。

由表2可以看出，前5个主成分特征值均大于1，累计贡献率为87.179%，可以表征原始因子代表的全部信息，故选取前5个主成分进行分析。

表2 烟叶指纹图谱共有峰峰面积的主成分分析

根据主成分的因子载荷矩阵可以得到每个主成分的信息来源。由表3可以看出，第1主成分中的信息主要来自色谱峰3、4、6、9、10、14、15、16，第2主成分中的信息主要来自色谱峰1、5、11，第3主成分中的信息主要来自色谱峰8，第4主成分中的信息主要来自色谱峰7，第5主成分中的信息主要来自色谱峰12。

表3 前5个主成分的因子载荷矩阵

由于主成分载荷矩阵U和因子载荷矩阵A满足式(1)的关系，故可得主成分的载荷矩阵。将主成分的载荷矩阵与标准化后的原始数据相结合，即可得到主成分的综合评价得分，如表4所示。

表4 前5个主成分的主成分得分值

其中，λi为主成分的特征值。

从表4来看，在成分1中样品13得分最高，表明其包含色谱峰3、4、6、9、10、14、15、16的信息最为丰富；成分2中样品83得到最高，表明其包含色谱峰1、5、11的信息最为丰富；成分3中样品56得分最高，表明其包含色谱峰8的信息最为丰富；成分4中样品40得分最高，表明其包含色谱峰7的信息最为丰富；成分5中样品58得分最高，表明其包含色谱峰12的信息最为丰富。

2.2 烟叶化学成分相关性分析

相关性分析是研究2个或2个以上处于同等地位的随机变量间相关关系的统计分析方法。它是描述客观事物之间相互关系的密切程度并用适当的统计指标将其表示出来的过程。2个变量之间的相关程度通常用相关系数r来表示。相关系数r的取值在-1～1之间，它可以是此范围内的任何值。正相关时，r值在0～1之间，此时一个变量增加，另一个变量也增加；负相关时，r值在-1～0之间，此时一个变量增加，另一个变量将减少。r的绝对值越接近于1，2个变量间的关联程度越强，r的值越接近于0，2个变量间的关联程度越弱。在进行回归分析时，经常研究因变量与多个自变量之间的相关程度，此时可以使用复相关系数。

由于14批B2F下限等级的烟叶样品中，湖北咸丰、贵州威宁2批烟叶样品的常规化学成分含量数据暂未获取，因此选用数据完整的12批烟叶样品进行分析，不同产地烟叶样品的常规化学成分数据如表5所示。将主成分得分值与烟叶化学成分做相关性分析，结果如表6所示。

表5 不同产地烟叶常规化学成分%

表6 主成分与化学成分相关性分析

由表6可知，钾与第1主成分呈极显著的正相关，与主成分值的复相关也达到了极显著水平；总糖与第1主成分呈显著的负相关。

2.3 应用指纹图谱的聚类分析对烟叶品质进行分类

聚类分析是指将不同的样本分类到不同的类或簇的过程，其与分类的区别在于，聚类所要求划分的类是未知的。一般来说，同一个类中的对象有很大的相似性，而不同类间的对象有很大的相异性。

根据主成分得分值对12批烟叶样品进行聚类分析，得到的系统聚类系谱图（图4）。根据谱系图可将等级为B2F下限的12批烟叶样品大致分为3类。样品产区湖北十堰房县、四川凉山会东为第1类，样品产区湖北恩施宣恩、云南马龙、湖北保康、黑龙江林口、河南驻马店、云南沾益为第2类，样品产区安徽皖南宣城、福建龙岩、湖南永州、湖北襄阳保康为第3类。

图4 系统聚类谱系图

对3类烟叶中各种化学成分的含量进行分析，分析结果如表7所示。

表7 不同类别烟叶化学成分含量范围%

由之前相关分析的结果可知，钾和主成分值之间极显著相关，而由聚类结果可以发现，根据钾的含量可以较好地区分第1类样品与第2类样品。对于氯的含量，第2类样品中有一半达到了0.7以上，明显高于第1、3类样品。而对于其他4种化学成分，3类样品间区分度较低。

3 结论与讨论

比对烤烟的高效液相指纹图谱特征峰，可以找到不同烤烟中化学成分的区别，结合主成分分析和化学成分相关性分析以及聚类分析结果可以初步判别不同产地烤烟的品质。不同产区、品种、等级的烟叶，究其原因是烟叶中的多种化学成分组成或组成比例的不同，而指纹图谱可以将烤烟看作一个整体对其中的化学成分进行整体的把控，从而降低从单项化学成分来评价烤烟质量的不准确性。通过指纹图谱对烤烟中多种化学成分的含量进行比较，可以找到不同产区烟叶的成分差异。但如果只通过指纹图谱比较其中的多个色谱峰信息，从中找出区别并以此来区分产区的话，因变量太多以致推断过程繁琐难以实施。为此，笔者结合主成分分析法来选取能够反映综合信息的代表值，将众多的峰信息转换成较少的变量。相关性分析可以看出，前5个主成分与烟叶中钾、总糖达到了显著或极显著的相关性，可见指纹图谱主成分分析可以用来对烟叶进行质量控制，并以此建立烤烟品质评价的标准，这将极大减轻品吸师的工作量。不同产区之间的聚类结果表明，钾含量与氯含量等烟叶中化学品质成分指标在同一类别中结果相近，所以基于HPLC指纹图谱进行的聚类分析基本可以区分不同产区的烤烟，从而给烟叶的种植培养和加工提供理论依据。

在烟草行业中，将指纹图谱与主成分分析、聚类分析结合起来应用的例子也有一些报道。唐徐红[15]采用指纹图谱结合主成分分析、聚类分析等方法对云南省15个典型烟叶产区C3F等级的烟叶进行了质量分类。结果表明，2010年收获的云南省典型烟叶产区的烟叶质量可分成4个基本类型，区分结果较好。向刚[16]利用超声萃取-超高效液相色谱法对30个烟草样品（4个品种）的多酚类物质进行了快速分离与检测，建立了不同种类烟草中多酚类物质的UPLC指纹图谱，并对烟草样品进行了聚类分析。结果表明，这种基于烟草多酚指纹图谱的分析策略是一种可同时实现整体性、模糊性分析且简便易行的方法模式，为烟草识别及烟草制品的质量控制提供了部分科学依据。杨军[17]建立了1115烟用香精香料的气相色谱指纹图谱，并分析了9个不同批次的1115烟用香精香料样品，结合系统聚类分析法区分了不同批次的样品指纹图谱，并进一步通过掺兑试验验证了方法用于烟用香精质量控制的可行性。这些研究都证明了指纹图谱技术用于烟叶和烟用香精的质量评价与分类是完全可行的。

近年来，各种分析技术越来越完善，分析仪器的准确度和精确度也越来越高。与其他的烟草品质和种类鉴别方法相比，指纹图谱技术具有多成分控制、准确以及快速的优点。当前指纹图谱技术在烟草鉴定应用中主要是用来鉴别烟用香精的种类[18-19]，在烤烟产地鉴别中也有一些应用[20-21]，但在烟草其他方面应用较少，指纹图谱在烟草行业中还存在着巨大的应用潜力。但图谱建立过程较为繁琐，并且需要的样品数较大；指纹图谱包含的潜在信息量非常大，包含有杂质或与指纹图谱研究无关的信息，因此结合统计分析方法对信息进行整理，在保留原始特征信息的同时根据实际情况进行优化是非常有必要的。

本研究因不同产地同一等级样本量相对较少，指纹图谱评估结果可能存在偶然性，日后可提高样本量或进行平行试验减小偶然性误差。今后的研究可基于指纹图谱发展思路，将其他现代化分析技术，如液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术、光谱学等技术手段应用到烤烟质量分类研究中，实现烤烟的快速质量分类鉴别。

人们逐渐意识到指纹图谱技术在烟草品质评价中的便捷性，针对烟草指纹图谱的研究也发展迅速，指纹图谱技术将会在烟草品质鉴别中起到主导作用。可以通过指纹图谱发现市面上的伪劣产品，这能有效地遏制烟草市场混杂的局面。此外，还能通过指纹图谱对烟草进行产地识别，对品质较好的烟草的生长环境进行研究，对其所需的土壤条件、水分、光照、生长周期及加工工艺进行考察，筛选出烟草比较合适的生长环境和气候，助力烟草病虫害的防控以及烟草品质的控制，以促进烟草产业现代化进程。