TRAF6通过内源性凋亡通路促进卡介苗诱导的巨噬细胞凋亡

结核分枝杆菌（Mtb）是引起结核病的单一传染性致病菌。Mtb入侵时，巨噬细胞通过募集溶酶体水解酶、产生氮物质和活性氧、促进吞噬体与溶酶体融合、表达和运输主要组织相容性复合物II类（MHC II），促进自噬和细胞凋亡等多种方式阻止Mtb在胞内增殖。细胞凋亡作为感染早期巨噬细胞对抗Mtb的主要防御机制，除消除有利于Mtb增殖的细胞内环境外，其还会通过将凋亡小体递送至树突状细胞促进Mtb抗原交叉呈递触发免疫反应。然而，Mtb 分泌的毒力因子Rv3654c和Rv3655c可通过调节NO和促炎因子抑制巨噬细胞凋亡。因此，全面了解Mtb与细胞凋亡之间的博弈过程对了解Mtb与宿主细胞的动态拮抗作用至关重要。

肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）作为一种衔接蛋白，在调节细胞存活、增殖、凋亡和Mtb感染中发挥重要作用。最新研究发现，TRAF6通过激活NF-κB信号通路促进LPS诱导的软骨细胞凋亡。同时，在TLR2参与诱导的巨噬细胞对Mtb的炎症/免疫抑制反应中，Mtb 抑制TRAF6 蛋白水平的同时显著增强TRAF6在mRNA水平的表达。也有研究表明，Mtb Rv2626c与TRAF6相互作用抑制巨噬细胞中TLR4炎症信号的传导。但是目前，Mtb感染巨噬细胞引发细胞凋亡过程中TRAF6是否参与其中有待阐明。本研究采用牛分枝杆菌疫苗株卡介苗（BCG）感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，观察敲低TRAF6对BCG诱导巨噬细胞凋亡的调控作用及机制，为深入探讨调控RAW264.7细胞凋亡的分子机制和靶向凋亡协助结核病治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）。在37 ℃，5%CO的培养条件下，将RAW264.7巨噬细胞复苏在含有90%DMEM高糖培养基（Gibco）、10%胎牛血清（Gibco）的细胞培养基中。

1.2 菌株

牛分枝杆菌疫苗株卡介苗（BCG）（上海生物制品研究所有限公司）。在添加OADC的7H9培养基中生长至对数期后感染细胞。

1.3 临床样品收集

50例活动性结核患者以及50例健康对照人群的外周血标本均收集自宁夏回族自治区第四人民医院。研究获宁夏回族自治区第四人民医院伦理委员会批准。

1.4 活动性结核患者的纳入和排除标准

时间梯度：利用BCG感染RAW264.7细胞，根据感染时间的不同，将处理组分为5组，分别是：对照组（C）、BCG感染6 h组、BCG感染12 h组、BCG感染18 h组和BCG感染24 h组；浓度梯度：利用BCG感染RAW264.7细胞，根据感染复数的不同，将处理组分为5组，分别是：对照组（C）、5 MOI组、10 MOI组、15 MOI组和20 MOI组；小干扰RNA筛选：利用脂质体转染技术将设计合成的3 条小干扰RNA 和阴性对照分别转染进RAW264.7细胞。根据干扰位点分别将其命名为：阴性对照组（NC）、1153组、1810组和4524组；干扰试验共分为4 组：分别为阴性对照组（NC）、BCG 单独感染组（BCG）、TRAF6 小干扰RNA 单独处理组（siRNA）和TRAF6小干扰RNA与BCG共处理组（siRNA+BCG）；NC 组和BCG 单独感染组均转染小干扰RNA NC，siRNA 组和siRNA+BCG 组分别转染TRAF6 小干扰RNA，转染24 h 后，BCG 组和siRNA+BCG 组感染BCG（MOI=15）18 h。

排除标准：（1）患者患有免疫缺陷类疾病或其它免疫系统疾病；（2）患者合并有肺癌、慢性阻塞性肺病或其它肺部疾病；（3）受到乙型肝炎病毒或其他细菌、病毒感染的患者；（4）患者合并有其它部位的结核、合并心脏疾病或组织器官的衰竭。

其次，高校文书档案是总结管理得失、开展科学管理的重要依据。文书档案是在学校发展建设中形成的，记录了学校管理的得与失、好与坏、利与弊，这些都为科学管理提供了资料参考，为科学决策提供了数据依据。

1.5 健康对照人群的纳入和排除标准

将6孔细胞培养板置于冰上。每孔加入1 mLTrizol反复吹打后转移至EP管中，静置10 min。按照5∶1的比例在1 mL Triozl中加入200 μL氯仿，上下颠倒混匀后静置2～3 min，12 000 r/min离心15 min。吸取最上层的透明液体约400 μL加入等体积的异丙醇，静置30 min，12 000 r/min离心10 min。尽可能吸取上清后，每个样品加入1 mL 75%乙醇，混匀后静置10 min，12 000 r/min离心5 min。弃乙醇，每管加入100 μL 无核酶水，65 ℃水浴锅助溶5 min。利用Nanodrop 8000检测RNA浓度与纯度。

排除标准：（1）调查对象有乙肝、丙肝、艾滋等病毒或其他细菌感染；（2）调查对象为孕妇或哺乳期妇女；（3）调查对象近期有手术史；（4）调查对象近期有服用免疫类药物、激素类药物的经历；（5）调查对象不全或拒绝参与调查研究。

1.6 外周血样本RNA的提取

调查对象于空腹状态下，采用EDTA抗凝管抽取外周血4～5 mL。将全血与RNA保护剂以3∶7的比例混合利用血液离心柱型总RNA提取试剂盒（无锡百泰克生物技术有限公司）提取全周血内总RNA。

1.7 RAW264.7细胞RNA提取

纳入标准：（1）调查对象既往身体健康，无高血压等慢性疾病，无糖尿病、恶性肿瘤、结核病病史、近1月内未使用免疫激活或抑制类药物；（2）调查对象近两周内未有病毒、细菌感染病史；（3）调查对象体检无异常表现，血液常规检测显示巨噬细胞、单核细胞、粒细胞等指标在正常范围内。

1.8 Q-PCR检测TRAF6的表达

使用TransStart Tip Green Q-PCR Super Mix 对TRAF6进行检测。将反转录的cDNA稀释10倍后备用，依次加入F引物、R引物、cDNA模板和ddHO（总体系20 μL）；随后，采用Quant Studio 5 Real-time PCR仪进行扩增检测；程序运行结束后，采用2法计算相对表达量（表1）。

1.9 TRAF6小干扰RNA设计

为探讨敲减TRAF6对BCG感染的巨噬细胞凋亡的调控作用，流式细胞术被利用检测细胞凋亡率的变化。结果显示：BCG感染RAW264.7后巨噬细胞凋亡率与对照组相比显著上调（＜0.001），但敲减TRAF6显著抑制BCG诱导的巨噬细胞凋亡率（＜0.001，图4）。

1.10 平板涂布法检测巨噬细胞菌载量变化

由于BCG感染后TRAF6表达发生上调，本研究设计合成了3个TRAF6的小干扰RNA敲减RAW264.7细胞内TRAF6的表达。结果显示（图2A），siRNA-1810的干扰效果最佳（=0.004），因此后续实验均采用1810号小干扰RNA。通过Western blot检测不同处理组中TRAF6的表达差异，结果显示，siRNA-TRAF6显著下调BCG 感染后巨噬细胞内TRAF6 的表达（=0.002，图2B）。随后，进一步通过免疫荧光检测TRAF6的表达，BCG感染显著增加巨噬细胞内TRAF6的绿色荧光斑点，而TRAF6小干扰RNA处理后，BCG感染巨噬细胞造成的荧光强度显著减少（图2C）。

1.11 Western blot检测蛋白表达

例如：在设计三维目标时，教师在确定了教学目标之后，可以将其转化为教学策略与教学手段，同时，结合教学目标，教师更能明确学生所需掌握的知识与技能，从而在课堂教学过程中更具目的性，教学效率也会更高。

1.12 免疫荧光检测蛋白表达

细胞在12孔细胞培养板中培养。用4%多聚甲醛固定RAW264.7巨噬细胞，随后用0.5%Triton X-100通透30 min并用3%BSA封闭细胞1 h。在37 ℃下将细胞与包括抗TRAF6（1∶200，Abcam）或Caspase 3（1∶200,Protein tech）在内的一抗抗体孵育2 h。用PBS洗涤3次后，将细胞与Alexa Fluor 488/555偶联的二抗在室温下孵育1 h。然后用DAPI（中山金桥生物技术有限公司）封片。通过激光共聚焦显微镜测定荧光强度。

我第一次见到朱炳仁，是在他的作品在北京展出的时候。我对他展示的各种各样的作品感到有点困惑。我意识到，如果你想了解这种艺术手法，就需要从多方面了解这个艺术家。我们开始交谈，很快就开始谈论技术和技巧，我们俩都被技巧所吸引。他邀请我去吃晚饭，在那里我们聊得更久更深入。

1.13 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡率

用BCG 和/或TRAF6 小干扰RNA 处理后，收集RAW264.7细胞并根据制造商的说明使用Annexin VFITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物技术发展有限公司）评估细胞凋亡。在1×Binding buffer中重悬细胞后，使用PI 和Annexin V-FITC 对细胞进行避光染色。流式细胞仪检测荧光以评估细胞凋亡的百分比。

2.2 两组患儿治疗前后呼吸指数指标比较 治疗前两组患儿呼吸指数指标比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，治疗后患儿心率、呼吸显著降低，氧合指数显著升高，且观察组患儿心率、呼吸显著低于对照组,氧合指数显著高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

1.14 流式细胞术检测RAW264.7 细胞线粒体膜电位

根据制造商的说明，增强型线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）被利用检测线粒体膜电位变化。收集RAW264.7细胞后取500 μL JC-1染色液重悬细胞。将细胞在37 ℃培养箱中避光培养20 min。染色后，将细胞用PBS洗涤2次，并通过流式细胞仪进行分析。

1.15 试验分组设计

纳入标准：活动性结核诊断参照中华医学会肺结核基层诊疗指南（2018年）以及肺结核诊断和治疗指南（2001年）。纳入研究的患者标准包括：（1）患者痰液中检出Mtb或Mtb体外培养为阳性；（2）患者的痰涂片为阴性，但影像学、临床症状及相关检查确诊为肺结核。

1.16 数据分析

所有数据均表示为3次独立实验的均数±标准差。通过GraphPad Prism 9.0进行统计分析。两组间比较采用检验，多组间比较采用单因素方差分析，＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BCG感染RAW264.7巨噬细胞促进TRAF6与凋亡标志蛋白Caspase 3的表达

Mtb感染会导致宿主外周血、外周血单核/巨噬细胞中的多种蛋白差异表达。因此，本研究分别收集了50例活动性结核患者和50例健康人群的外周血并利用QPCR对TRAF6的表达变化进行检测，结果显示，与健康人群相比，TRAF6在活动性结核患者外周血中高表达（＜0.001，图1A）。为进一步明确BCG感染RAW264.7细胞对TRAF6表达的影响，本实验首先利用Q-PCR对不同处理时间与不同感染复数下TRAF6 mRNA的表达水平进行检测。结果显示，随着BCG感染时间与感染复数的不断增加，细胞内TRAF6 mRNA水平表达量逐渐上调，且在感染时间为18 h（＜0.001），感染复数为15（＜0.001，图1B）时，TRAF6表达量达到最高。随后，我们再次利用Western blot检测BCG不同感染时间对TRAF6与凋亡标志蛋白Caspase 3表达的影响。结果显示BCG感染18 h时TRAF6（=0.03）和Caspase 3的表达量达到最高（=0.04，图1C），而24 h时两者的表达均出现下调趋势。由此可见，BCG感染RAW264.7细胞18 h可显著上调TRAF6和Caspase 3蛋白的表达。随后，以18 h作为BCG的感染时间，设置BCG不同感染复数感染RAW264.7细胞。结果显示在感染复数为15时TRAF6（＜0.001）和Caspase 3的表达量显著高于对照组（＜0.001，图1D）。综上，我们确定TRAF6在活动性结核患者外周血中表达上调并在体内实验的基础上明确了BCG诱导RAW264.7细胞凋亡和TRAF6表达的最佳感染条件，即感染时间为18 h，感染复数为15。

2.2 小干扰RNA下调巨噬细胞内TRAF6表达

实验处理结束后，利用0.1%TritonX-100裂解细胞并收集上清，5000 r/min，离心5 min。弃掉上清后，用PBS将沉淀梯度稀释涂布于7H10平板上，37 ℃恒温培养14 d后计数。

2.3 敲减TRAF6促进BCG诱导的巨噬细胞菌载量

将BCG感染后的RAW264.7细胞裂解后利用平板涂布法梯度稀释于7H10平板上，37 ℃恒温培育后检测敲减TRAF6对巨噬细胞菌载量的影响。结果显示：与BCG单独处理组相比，敲减TRAF6显著上调巨噬细胞菌载量（=0.04，图3）。

结束实验处理后，将贴壁生长在6 孔板的RAW264.7细胞用PBS洗涤3次。细胞在含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解以提取总蛋白，并根据BCA蛋白定量试剂盒（Thermo fisher）测定蛋白浓度。随后，用SDS-PAGE电泳缓冲液分离蛋白，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h后，将膜与TRAF6（Abcam）、Caspase 3（Protein tech）、PARP（Cell Signal Technology）、Bcl-2（Protein tech）、BAX（Protein tech）以及β-actin（Protein tech）蛋白抗体一起4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤后，将膜与相应的二抗在室温下孵育1 h。使用增强化学发光试剂检测蛋白条带，条带密度通过Image J进行量化的同时利用β-actin作为样品标准化对照。

2.4 敲减TRAF6抑制BCG感染的巨噬细胞RAW264.7的凋亡率

在NCBI数据库中查询鼠源TRAF6 mRNA的全长序列，找到其蛋白编码区（CDS），将该CDS区序列复制粘贴到在线设计网站（httPs://www.invivogen.com/sirnawizard/design.PhP）中，将符合设计条件的多条小干扰RNA置于NCBI的BLAST数据库中进行比对后将3条条件最佳的TRAF6小干扰RNA送至上海吉玛制药技术有限公司合成。具体序列如下（表2）。

2.5 敲减TRAF6下调BCG诱导的细胞凋亡蛋白的表达

TRAF6 小干扰RNA 显著抑制BCG 感染的RAW264.7巨噬细胞中Caspase 3（=0.002）和PARP的表达（＜0.001，图5A）。同时，免疫荧光结果显示（图5B），BCG感染诱导了Caspase 3的表达，而TRAF6小干扰RNA显著抑制BCG感染诱导的Caspase 3的表达，这与Western blot结果一致。

口腔种植系统能否种植成功主要取决于牙槽骨和种植体之间的结合度,这种结合称之为骨性结合,而这种结合程度主要受种植材料以及表面处理技术的影响。种植体表面需要更好的生物活性,对血液中的蛋白成分有一定的吸附作用,进而才能加快骨结合速度,这种方法充分利用了化学技术,使植入体材料表面变得粗糙,同时也具备良好的亲水性能。不但如此,医疗人员还考虑通过纳米结构加快骨结合[3]。

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2.6 敲减TRAF6抑制内源性凋亡信号通路的激活

与对照组相比，BCG感染后巨噬细胞膜电位显著上调（＜0.001），而敲减TRAF6后线粒体膜电位显著下调（＜0.001，图6A）。Western blot被利用检测内源性凋亡标志蛋白Bcl-2与BAX的表达，结果显示，敲减TRAF6显著下调BCG诱导的巨噬细胞中BAX表达（=0.005）的同时显著上调Bcl-2的表达水平（=0.04，图6B）。

3 讨论

作为结核病的致病菌，由于能够在免疫功能正常的巨噬细胞中持续存活，Mtb被认为是侵入机体最成功的传染性病原体。一旦进入下呼吸道，Mtb主要被巨噬细胞和树突状细胞吞噬杀灭。然而，分枝杆菌的最新进展表明，Mtb可以通过阻断巨噬细胞凋亡帮助病原体在宿主中获得稳定的生存优势。将受感染巨噬细胞的“死亡”模式转为坏死就是其中之一。细胞凋亡的诱导与分枝杆菌的毒力有关，研究表明，与H37Rv相比，BCG和H37Ra等弱毒株主要诱导细胞凋亡。一致的是，我们通过BCG不同感染时间与BCG不同感染复数检测凋亡标志蛋白Caspase 3的表达，发现BCG感染后Caspase 3的表达呈浓度与时间依赖性。

于治疗前与治疗后，检查：（1）牙周袋探诊深度。牙周探针探测从牙周袋底至龈缘距离；（2）临床附着水平。牙周袋底至釉牙骨质界的距离；（3）牙龈指数。采用文献[4]中的gingival index法，检查全口四个牙面记分平均值，0～3分别表示牙龈健康、牙龈轻度炎症、牙龈中度炎症、牙龈严重炎症；（4）牙槽骨高度。釉牙骨质界至牙槽嵴顶之间距离；（5）牙齿松动度。前牙松动度：使用牙科镊夹住前牙切缘，坐唇舌或近远中方向摇动。后牙松动度：闭合镊子，其尖端抵住面窝，向颊舌或近远中方向摇动。根据摇动程度分别记录1度、2度、3度。

TRAF6作为肿瘤坏死因子受体家族的标志蛋白，是Toll样受体（TLR）家族信号传导的下游分子，参与Mtb感染并调节细胞凋亡过程。作为一种衔接蛋白，其主要通过与TNFR和Toll/IL-1R家族成员的胞质尾部结合，介导TNFR和Toll/IL-1R家族成员参与的信号转导过程。通常而言，Mtb感染期间，巨噬细胞通过模式识别受体（PRRs）识别入侵的Mtb，信号经TRAF6传导激活NF-κB以及MAPK（如ERKs、JNKs和P38）信号通路，最终导致炎性细胞因子的释放和抗菌介质的产生。研究表明，过表达TRAF6导致Mtb感染的巨噬细胞中促炎因子水平升高。而牛等人的研究表明，抑制TRAF6表达会导致NF-κB信号减弱，从而抑制巨噬细胞中细胞因子的产生并促进Mtb存活。TRAF6与Mtb之间的复杂关系不仅表现为TRAF6通过NF-κB途径促进Mtb的存活，很多研究也表明，TRAF6与细胞凋亡间存在复杂的作用关系。以结肠癌样本为例，过表达TRAF6抑制细胞凋亡率。本研究发现，活动性结核病人外周血中TRAF6 表达量显著上调，BCG 感染RAW264.7细胞后TRAF6的表达与该结果一致。为进一步验证TRAF6是否参与BCG诱导的巨噬细胞凋亡，TRAF6 小干扰RNA 被利用检测敲减TRAF6 是否对BCG诱导的巨噬细胞凋亡具有调控作用。我们的研究发现，与BCG单独感染组相比，TRAF6小干扰RNA显著抑制BCG 诱导的巨噬细胞凋亡。本研究证实TRAF6以正调控方式参与BCG诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡。

细胞内源性凋亡途径又称线粒体凋亡通路，是由DNA 损伤引起的细胞内稳态失衡。接收刺激后，BAX和BAK在线粒体外膜打孔降低线粒体外膜通透性，释放的细胞色素c与APAF1和Caspase 9形成凋亡小体并激活Caspase 3。在大多数哺乳动物细胞中，细胞色素c释放到细胞质中是触发细胞凋亡的关键条件，它被认为是凋亡细胞死亡的不可逆转点。促凋亡的BCL-2家族成员如BAX、BAK、BIM、BID、PUMA对细胞色素c的释放起正调节作用，而抗凋亡的BCL-2家族成员如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、A1和MCL1对细胞色素c的释放起负调节作用。已有文献表明，稳定表达BAX的新型重组BCG菌株(rBCG::BAX)无论在体外还是体内均能显着诱导感染rBCG:BAX的巨噬细胞凋亡。甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖是分支杆菌属表面主要的糖脂成分，在BCG感染的巨噬细胞中通过稳定表达Bcl-2和下调BAX表达来保护巨噬细胞免受凋亡，从而促进巨噬细胞感染。TRAF6作为调节免疫和炎症信号的重要分子，在黑色素瘤细胞的相关研究中发现，TRAF6水平的降低直接影响凋亡蛋白BAX和Caspase 3的激活。本实验研究发现敲减TRAF6后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高，最终积聚于线粒体外膜的BAX活性被抑制导致线粒体膜通透性降低，使线粒体内膜中的细胞色素c的表达被抑制，从而影响Caspase的级联反映。

（1）聚焦课堂。引导教师在教学中体现“尊重之道、引导之法、激发之术”，积极推进课堂改革的四个“化”：一是国家课程校本化。允许、鼓励教师结合实际对国家课程进行校本化处理，如整合教学内容、调整模块顺序、自编学习教材、创新教学方式。二是课程开发学科化。引导教师在教学中关注课程内容的纵向拓展和横向整合，关注对学生的生涯指导和知识的学以致用。三是优质课堂多元化。鼓励教师不拘泥于固有教学模式，积极探索基于信息技术的多元互动课堂，着力构建问题导向、高阶思维的高效课堂。四是分层教学个性化。学校率先在广州市探索高中分层走班教学改革，根据学生的学习层次和认知水平实施个性化分层教学。

综上所述，本研究首次探讨了TRAF6与BCG诱导巨噬细胞凋亡之间的关系，并得出TRAF6通过内源性凋亡信号通路调控BCG诱导的巨噬细胞凋亡。研究结果丰富了BCG 诱导细胞凋亡的基础研究内容，也为Mtb致病机制的解读提供了新的视角。