2-脱氧葡萄糖联合奥希替尼对非小细胞肺癌细胞株H1975耐药性、糖酵解水平表达和增殖活性的影响*

胡海峰，雒小佳

延安大学附属医院肿瘤科二病区，陕西延安 716000

肺癌是我国发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌患者的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低，患者生存时间和生活质量亟待提高[2-4]。奥希替尼在国内获批的适应证是既往使用表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗时或治疗后出现疾病进展，并且经检验确认存在EGFR T790M 突变阳性的局部晚期或转移性成人NSCLC[5]。奥希替尼已经成为各大指南推荐的首选靶向药，可延长肺癌患者生存时间[6]。但是奥希替尼也存在肿瘤耐药的问题，一旦出现肿瘤耐药，奥希替尼的疗效就明显下降，肺癌开始加重。2-脱氧葡萄糖是天然抗代谢物类抗菌药物，具有能够抑制病毒感染、酵母发酵、病菌及肿瘤细胞生长等多种生理药理效应[7]，具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗癫痫、抗衰老等作用，用于预防病毒及病原菌感染等，可防治单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒等病原菌引起的传染病，主要用于各种畜禽病毒病、免疫抑制病的预防和治疗，也可用于细菌及支原体感染的辅助治疗，在医药及化妆品等行业具有广泛的应用前景[8]。因此，本研究探讨2-脱氧葡萄糖联合奥希替尼对NSCLC细胞株H1975耐药性、糖酵解水平表达情况的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 将NSCLC细胞株H1975(美国国家细胞库)经过体外诱导处理48 h后，37 ℃，建立奥希替尼(0.5 μmol/L)继发性耐药NSCLC细胞株H1975-OR[9]。

1.2方法 用流式细胞分析仪检测药物处理后的细胞凋亡率，评估药物的促凋亡能力。

1.2.1MTT 法检测不同细胞对奥希替尼的敏感性[10](1)MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT水平为5 mg/mL。因此，可以称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸盐缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放置于4 ℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。(2)配制MTT时用PBS(pH=7.4)溶解。(3)PBS配方：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g调pH为7.4，定容1 μL。(4)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL，铺板使待测细胞密度调整为1 000～10 000/孔。(5)5%的CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物。一般5～7个梯度，每孔100 μL，设3～5个复孔。(6)5%的CO2，37 ℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。(7)每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。(8)终止培养，小心吸去孔内培养液。(9)每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。(10)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。细胞存活率=药物处理组A值/对照组A值×100%。

1.2.2siRNA细胞转染[11](1)提前1 d将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45 mL。(2)取0.67 g(50 pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25 μL。注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640培养基。(3)取1 L的EntransterTM-R4000，然后加入24 μL无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25 μL。室温静置5 min。(4)将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合，室温静置15 min。转染复合物制备完成。(5)将50 L转染复合物滴入0.45 mL全培养基(可含10%血清和抗菌药物)的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。注意：采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。(6)转染后6 h观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24～96 h得到结果。

1.2.3糖酵解水平的检测 采用比色法检测细胞外乳酸浓度。将细胞株H1975-OR、细胞株H1975接种于96孔板(104/孔，100 μL)，待细胞贴壁后加入奥希替尼处理48 h。收集细胞和培养基，参照试剂盒说明书进行操作，检测培养基中的乳酸浓度。

1.2.4CCK-8法检测细胞的耐药性 取对数生长期细胞株H1975-OR、细胞株H1975单细胞悬液接种于96孔板，3×103/孔；培养24 h后，加入含相应浓度奥希替尼的培养液每孔200 μL，每个药物浓度设5个复孔；继续培养72 h，仔细吸弃各孔培养液，每孔加入RPMI 1640培养基100 μL和CCK-8试剂10 μL，继续培养1 h；在酶联免疫吸附法检测仪上于490 nm波长下检测各孔的A值，采用Graphpad Prism 6.0软件计算各组细胞的半数抑制浓度(IC50)。

2 结 果

2.1细胞株H1975-OR与细胞株H1975对奥希替尼的敏感性 细胞株H1975-OR对奥希替尼的敏感性为(0.95±0.18)μmol/L，低于细胞株H1975的(6.99±1.88)μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2奥希替尼对细胞株H1975-OR和细胞株H1975增殖活性的影响 采用同一水平的奥希替尼(3 μmol/L)处理细胞株H1975-OR和细胞株H1975，细胞株H1975-OR增殖活性被抑制程度低于细胞株H1975。见图1。

图1 细胞株H1975-OR和细胞株H1975在奥希替尼作用后的细胞存活曲线

2.3细胞株H1975-OR与细胞株H1975糖酵解水平比较 细胞株H1975-OR的糖酵解水平为(20.87±0.86)mmol/L，低于细胞株H1975的(25.93±2.94)mmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.42-脱氧葡萄糖可逆转细胞株H1975-OR对奥希替尼的耐药性 当2-脱氧葡萄糖的水平为4 mmol/L时，细胞株H1975-OR对奥希替尼的IC50值为(1.39±0.11)μmol/L，与奥希替尼敏感细胞株H1975的(1.01±0.19)μmol/L相似。

2.5奥希替尼对细胞株H1975-OR抗增殖效果 细胞株H1975-OR的细胞存活率如下：G1期，(0.046±0.020)%；G2期，(0.178±0.028)%；G3期，(0.395±0.082)%；G4期，(0.724±0.048)%。

3 讨 论

自工业时代以来，肺癌的发病率和病死率逐年上升，且速度极为惊人。肺癌是目前中国恶性肿瘤中病死率最高的一种癌症[12]。NSCLC相对于小细胞肺癌，发病慢，癌症的扩散速度较慢，但是一般发现即是晚期，非常难以控制和治疗。患者在早期出现肺部症状时，就应该及时就医，以提前预防和干预治疗[13-14]。NSCLC主要包括鳞癌、腺癌、大细胞肺癌，与小细胞癌相比，癌细胞生长分裂较慢、扩散转移相对较晚。根据最新的统计结果显示，大多数的患者在发现的时候就已处于中晚期，治疗相对不易，存活率也不高[15]。NSCLC的发病原因主要有吸烟、职业暴露所致、环境接触、电离辐射、既往肺部慢性感染、遗传等因素，其中吸烟是肺癌成因中最重要的一种因素，因为香烟中含有大量对肺部有害的物质，长期吸烟，对肺部的损伤是不可逆的。总之，NSCLC由于病情发展较慢，较容易延误治疗，患者在出现早期疑似症状的时候，就应该及时去正规医院进行诊断，通过X线检查、支气管镜检查、细胞学检查等现代医疗手段，进行确诊，如果确定是肺癌，也要保持积极乐观的心态，进行治疗干预，防止病情的进一步恶化[16]。

目前随着多项临床研究的开展，奥希替尼已被推荐用于肺癌的一线治疗。在对奥希替尼耐药的患者进行的基因检测中，H1975继发突变是常见的耐药突变，占15%～20%[17-18]。分顺式突变和反式突变，多以顺式突变为主。但奥希替尼是一种靶向药物，该药耐药之后如何用药对于患者至关重要，因此本研究探讨2-脱氧葡萄糖联合奥希替尼对NSCLC患者细胞株H1975耐药性、糖酵解水平的影响[19]。

2-脱氧葡萄糖的一种衍生物是一种抗代谢物，也是正粘病毒、副粘病毒及疱疹病毒囊膜的重要组成成分，具有干扰病毒特异性糖蛋白的合成，有效抑制疱疹单病毒、RNA和DNA包膜病毒、乳腺癌细胞增殖等功效。

本研究结果显示，细胞株H1975-OR对奥希替尼的敏感性为(0.95±0.18)μmol/L，低于细胞株H1975的(6.99±1.88)μmol/L(P<0.05)。细胞株H1975-OR的糖酵解水平为(20.87±0.86)mmol/L，低于细胞株H1975的(25.93±2.94)mmol/L(P<0.05)。当2-脱氧葡萄糖水平为4 mmol/L时，细胞株H1975-OR对奥希替尼的IC50值为(1.39±0.11)μmol/L，接近奥希替尼敏感细胞株H1975的(1.01±0.19)μmol/L。奥希替尼对细胞株H1975-OR作用后，细胞存活率如下：G1期，(0.046±0.020)%；G2期，(0.178±0.028)%；G3期，(0.395±0.082)%；G4期，(0.724±0.048)%。

综上所述，2-脱氧葡萄糖逆转NSCLC细胞对奥希替尼的继发性耐药，其机制与抑制细胞糖酵解进而诱导凋亡增加有关。