甘草内生菌研究概况

尤梦瑶，万 璐，闫佳佳，张 赫，郑春英

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

甘草为乌拉尔甘草(G.uralensis)、光果甘草(G.glabra)或胀果甘草(G.inflata)的干燥根和根茎[1]，具有抗菌[2]、抗氧化[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗糖尿病[6]等作用。目前，已从甘草中分离得到300多种黄酮类化合物[7]和50多种三萜类成分[8]及多糖[9]等成分，其中三萜类主要活性成分甘草次酸表现出了强大抗SARS病毒及HIV-1病毒的作用[10]，同时，其黄酮类主要活性成分甘草苷在新冠病毒(COVID-19)流行的大环境下也表现出了强大抗病毒能力，通过防止病毒进入受体细胞以及破坏病毒受体与靶细胞的结合来达到免受病毒危害的作用[11]。甘草及其主要活性成分现广泛应用于医药、食品、化妆品行业[12]。世界甘草年消费量为1000万t，其中90%来自中国，中国是甘草的主要生产区[13]。

寒地黑土造就了北方乌拉尔甘草的特有品质，是寒地龙药的领军品种。Wayne C.Liao等[14]在研究乌拉尔甘草与光果甘草品质时，采用HPLC和LC/MS方法同时检测乌拉尔甘草和光果甘草中15种活性成分，结果发现，乌拉尔甘草含有槲皮素成分；而光果甘草不含此成分；同时，自由基清除实验结果表明，乌拉尔甘草的作用优于光果甘草。

由于大量需求，野生乌拉尔甘草因过度采挖而濒临灭绝[15]，现已被列入《野生药材资源保护条例》的国家二级保护植物[16]，栽培种植虽然是解决甘草紧缺的替代方法[17]，但其采收期为2～3年，种植企业及农户资金回笼较慢，因此，采用微生物发酵法生产甘草活性成分是一个关键的课题。

1 植物内生菌

植物内生菌“Endophytes”是由DeBary在1866年首次提出的[18]，植物内生菌指生活在植物组织的微生物，用以区分那些生活在植物表面的微生物。1993年，Stierle.A等[19]采用微生物发酵法首次从短叶红豆杉韧皮部的内生真菌(Taxomyces andreanae)中分离到了紫杉醇。自此，越来越多的学者开始对植物内生真菌及其次生代谢产物展开了研究。

内生菌与宿主植物互利共生，内生菌可通过合成生物活性物质或刺激宿主植物合成次生代谢产物来抵御病原菌及外来物质的侵害，从而为宿主植物提供内生菌生存所必须的生活环境。内生菌在与宿主植物协同进化过程中，可以合成大量的活性代谢物[20]，如生物碱[21]、酚类[22]、醌类[23]、黄酮[24]等，还可以合成一些结构新颖的活性代谢物，因而具有重要的开发应用价值[25]。

植物内生菌的特点是种类多、数量大，因其种类的不同，研究人员把其大致划分为三大类，即：内生细菌、内生真菌和内生放线菌[26]。植物内生菌在陆生和水生植物中普遍存在，在植物的不同器官，甚至组织细胞以及细胞间隙中也存在。近年来，已从不同植物的不同植物器官中分离得到大量内生菌[27]。

内生真菌是植物中最丰富的内生菌之一。常见的内生真菌包括毛囊菌属、枝孢子菌属、毛霉、黑孢菌、青霉菌、多孔菌、木霉、毛藻等[28]。植物内生真菌的多样性还体现在其活性代谢物的多样性，如：Zheng[29]等从西洋参根部分离出内生真菌中检测到了人参皂苷、青霉酸、麦角甾醇以及布雷菲德菌素等代谢产物；He等[30]对藤黄内生真菌进行体外发酵培养，采用NMR、HPLC分析以及TLC检视等分析该菌株发酵后的活性代谢产物，结果发现，该菌株能够产生α-环己酮酸(α-CPA)、曲酸等特异性成分；Marie[31]等采用HPLC以及TLC检视，检测三七根内生真菌发酵后的代谢产物，发现发酵产物中既含有与宿主植物相同的吲哚-3-乙酸，也含有特异性成分黄柄曲霉素。

内生细菌可以分为兼性内生细菌和专性内生细菌，专性内生细菌存活条件相对苛刻，只能在植物体内生存，而兼性内生细菌不但可以存活在宿主植物体内，也可以存活在宿主植物的根际和其所在的土壤之中[32]；内生放线菌是指其生活史的部分或全部存在于健康植物的各种组织和器官内部，对宿主植物不构成危害的放线菌[33]。

2 甘草内生菌研究概况

2.1 甘草内生菌的分离和鉴定

国内对甘草内生菌的研究始于2007年，宋素琴等[34]首先从新疆胀果甘草不同组织段中分离得到149株内生细菌和2株内生真菌，此后对甘草内生菌的研究就成为一个热点。部分对甘草内生菌的分离和鉴定工作见表1。

表1 甘草内生菌的分离和鉴定

从表1可以看出，关于甘草内生菌的分离多采用表面消毒的方法，从其不同产地、不同甘草部位中分离内生细菌和内生真菌，并进行初步的菌种鉴定。

国外暂未见关于甘草内生菌及其活性代谢物研究的报道。

2.2 甘草内生菌的多样性

甘草内生菌的多样性体现在不同生态环境、不用产地下产内生菌的情况不同。孙一帆等[40]在比较野生甘草和栽培甘草内生菌的多样性发现，从内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗吉日嘎朗图镇野生甘草根中共分离得到的214株内生真菌，共归属为9个属，从北京中医药大学望京药园栽培甘草根中分离得到151株内生真菌，共归属为6个属，通过与北京中医药大学望京药园栽培甘草相比，结果发现内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗吉日嘎朗图镇野生甘草内生真菌具有更高的丰富度和多样性，这可能表明野生甘草为了适应更加恶劣的生态环境，其内生真菌具有较多的丰富度和多样性；陈静等[41]分别从甘肃、宁夏、内蒙、新疆、北京5个地区的129株乌拉尔甘草(G.uralensis)中共分离得到438株内生真菌，其中镰孢菌属(Fusarium)和曲霉属(Aspergillus)为优势菌属。通过研究甘草内生菌的多样性可以为甘草内生菌的资源利用和开发提供基础，也为进一步研究内生菌对甘草药材的质量影响提供理论依据。

2.3 甘草内生菌药理作用

2.3.1 抑菌作用 赵妮等[42]对甘肃野生与栽培的乌拉尔甘草菌进行分离，共分离得到20株内生细菌，其中18株内生细菌对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，3株内生细菌对肺炎链球菌有抑菌活性，并且其抑菌活性强于甘草总黄酮、水煎液或甘草总皂苷中的抑菌活性；朗多勇等[37]对宁夏盐池甘草(G.uralensis)进行分离共得到140株内生细菌，发现其中42株内生细菌对金黄色葡萄菌有抑菌作用，5株内生细菌对西瓜枯萎病菌有抑菌作用，10株内生细菌对烟草赤星病菌有抑菌作用，9株内生细菌对小麦枯萎病菌有抑菌作用，3株内生细菌对棉花枯萎病菌有抑菌作用，2株内生细菌对黄花枯萎病菌有抑菌作用；刘霞等[43]在探究甘草内生真菌对灰霉病菌的抑制活性时，发现其中1株内生菌株的发酵上清液可破坏灰霉病菌菌丝细胞的形态和结构，此外，该菌种在活体黄瓜幼苗中有一定的传导性。

2.3.2 降血糖 杨明俊等[44]对所分离得到的36株甘草内生真菌进行降血糖活力的测定，发现其中有6株内生真菌具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，表现出较好的降血糖能力。

2.3.3 止咳化痰作用 曼琼等[45]对从野生与栽培的乌拉尔甘草中分离、纯化得到的12株具有抑菌和抗炎作用的甘草内生细菌进行研究，发现其中有5株甘草内生菌对化痰作用有一定的改善作用；杨志军等[46]采用氨水引咳、SO2引咳来探究甘草内生菌与水煎液的止咳作用，发现2株甘草内生细菌具有止咳作用，1株甘草内生细菌具有祛痰作用。

2.3.4 抗肿瘤作用 王丽等[47]对甘草内生真菌dG9-1菌株发酵液进行3个浓度梯度的处理后进行肿瘤抑制实验，发现其高浓度的发酵液对宫颈肿瘤细胞Hela-60抑制率为35.9%，具有良好的抑制肿瘤作用。

2.4 甘草内生菌次生代谢产物研究

根据内生菌次生代谢产物与宿主植物具有相关性的理论，已有报道从甘草内生菌中分离出与甘草成分相同或相似的次生代谢产物，为进一步开发利用甘草内生菌奠定基础，甘草内生菌次生代谢产物提取分离情况见表2。

表2 甘草内生菌次生代谢产物提取分离

由表2可知，在甘草内生菌中含有甘草次酸、甘草苷、甘草素等与宿主植物相同的次生代谢产物，可以采用微生物发酵法生产上述原料，同时，在上述的研究工作中大多采用有机溶剂提取和柱色谱分离的方法，由于次生代谢产物在内生菌发酵液中的含量较低，导致分离通常存在一定的盲目性。因此为了系统研究甘草内生菌次生代谢产物，应在其提取分离前先对甘草内生菌发酵液进行系统分析，并根据分析结果进行有目的的系统分离。

3 展望

内生菌作为一种新型微生物资源，其研究工作一直以来都是国际研究的一个热点，但目前仍处于基础研究阶段[54]。近年来围绕甘草内生菌的相关研究逐步增多，这主要源于其主要活性成分甘草次酸及甘草苷的活性作用及其需求，但纵观甘草内生菌及其次生代谢产物的研究工作大多集中于内生菌分离鉴定，且虽然筛选得到能够产生与宿主植物相同次生代谢产物的目的菌株，但其产量低、次生代谢产物的提取分离工作尚未形成体系。

为了定向得到高产量的次生代谢产物，可以分析其生物合成途径，通过检测生物合成途径的前体化合物的存在，推测发酵后可能含有一些次生代谢产物，从而可以调控这个生物合成的途径，定向的生产目标产物。

同样，若想高效生产甘草苷也可以通过定向调控其生物合成途径、分析其前体化合物来实现。甘草苷生物合成途径见图1[55]。

图1 甘草苷生物合成途径

通过图1可发现查尔酮异构酶(CHI)是甘草苷的生物合成途径中的关键酶及限速酶。它能够催化分子内的环化反应，使双环的查尔酮转化为具有生物学活性的三环(2S)-黄烷酮，再进一步反应生成甘草苷。

此外，在甘草苷生物合成途径中，若在内生菌的发酵液中检测前体化合物反式肉桂酸等化合物的存在，可以推测在发酵的过程中可能含有异甘草素、查尔酮、甘草苷等一系列活性成分出现，从而可以调控这个生物合成的途径，定向的生产目标产物甘草苷。

同理，甘草次酸合成途径属于三萜化合物合成途径。首先，2,3氧化鲨烯为底物在β香树脂醇合酶催化下生成β-香树脂醇，之后由CPR催化β-香树脂醇碳11位首先羟基化，然后进一步氧化为11-氧-β-香树脂醇，在此基础上，由CPR继续催11-氧-β-香树脂醇碳30位羟基化，之后进一步氧化生成醛，最后氧化生成羧基形成甘草次酸，其具体合成途径见图2[55]。

通过图2可发现在次甘草酸生物合成途径中，若能在次生代谢产物的内生菌的发酵液中检测前体化合物的存在，可以推测在发酵的过程中含有甘草次酸等一系列活性成分出现，从而可以调控这个生物合成的途径，定向的生产目标产物甘草苷。

图2 甘草次酸生物合成途径

近年来，黄酮类、多糖类、皂苷类等活性成分可采用内生菌发酵法生产，从而解决由于资源稀缺、药用植物的市场受到限制等所引发的原料紧缺问题。因此，从甘草中分离内生菌，筛选具有活性的内生菌及其次生代谢产物，对于解决中国甘草野生资源匮乏、提供新型甘草活性成分生产方法具有重要的意义。