乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡生长性能、粗蛋白质表观代谢率及肠道健康的影响

程 鹏 张静博 赵龙妹 丁 轲 曹平华 马彦博 李 旺

(河南科技大学动物科技学院，洛阳471023)

益生菌作为绿色饲料添加剂在家禽生产中得到广泛应用。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作为益生菌主要菌种，是动物肠道的常驻菌，与其他细菌相比具有独特的生理特性及益生功能[1]，产生的酶能将饲粮中的粗蛋白质降解为小肽、游离氨基酸等小分子物质，增强营养物质的消化吸收，提高生长性能，促进免疫器官和免疫系统发育，提高抗病力[2-3]。乳酸菌可产生细菌素、乳酸、抑制蛋白等，抑制有害菌的生长[4]；维持消化道微生态平衡，保持畜禽肠道健康，提高养殖的经济效益[5-6]。饲粮中添加乳酸菌可促进雏鸡肠绒毛发育，改变肠黏膜结构，提高营养物质吸收和利用[7]；促进短链脂肪酸的形成，降低动物肠道pH，从而提高蛋白质溶解度，促进蛋白酶对蛋白质分解[8]。邓庆庆等[9]研究还发现，肉鸡饲喂乳酸菌制剂可以改善由黄曲霉毒素导致的生长性能下降，提高肉鸡营养物质表观代谢率，从而提高肉鸡生长性能。

乳酸菌菌种不耐高温，其固态制剂的干燥工艺多为真空冷冻干燥，成本过高，限制了其在动物养殖上使用。将乳酸菌菌液直接饲喂动物，则避免了干燥的环节，降低了使用成本。目前，乳酸菌菌液饲喂动物有多种方式，不同饲喂方式的效果缺乏比较。基于此，本试验通过饮水、灌服和拌料3种饲喂方式饲喂肉鸡乳酸菌菌液，研究其对肉鸡生长性能、粗蛋白质表观代谢率及肠道健康的影响，以期为乳酸菌菌液在肉鸡生产中科学应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物：192只1日龄爱拔益加(AA)肉鸡。

试验菌种：植物乳杆菌(L.plantarum)，本实验室前期筛选、鉴定并保存，试验前活化培养，活菌数为4×109CFU/mL。

基础饲粮：购自洛阳某饲料厂，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 试验设计和饲养管理

将192只1日龄肉鸡随机分为4个组，每组6个重复，每个重复8只鸡。对照组(CON组)饲喂基础饲粮；拌料组(MIX组)在基础饲粮中添加乳酸菌菌液；灌服组(OI组)饲喂基础饲粮，并口腔灌服乳酸菌菌液；饮水组(DW组)饲喂基础饲粮，并在饮水中添加乳酸菌菌液。饲养试验在河南科技大学牧场进行，采用2阶段笼养。试验期42 d。肉鸡自由采食、饮水，正常控温光照，全程无免疫。

为保证各组肉鸡每日采食乳酸菌活菌数基本相等(约8×108CFU)[10]。根据肉鸡在饲养过程中水料比3∶1原则、国家饲养标准及类似试验参考值，确定AA肉鸡平均日采食量(1～21日龄平均采食量48 g，22～42日龄平均采食量156 g)，通过计算确定不同饲喂方式下1～21日龄和22～42日龄的乳酸菌菌液添加量，如表2所示。MIX组每周及时进行拌料，OI组每日进行1次口腔灌服，DW组根据肉鸡饮水情况及时向水箱中补充混有乳酸菌菌液的饮用水。

表2 试验设计

乳酸菌实际摄入量是根据本试验肉鸡平均日采食量及饮水量得到的肉鸡实际每日摄入乳酸菌量。

Actual daily intake of lactic acid bacteria was the actual daily intake of lactic acid bacteria of broilers according to the average daily feed intake and drinking water of broilers in this experiment.

1.3 指标及测定方法

1.3.1 生长性能测定

每周记录每个重复投料量、剩料量和饮水量，在21、42日龄禁食12 h后，对每个重复的肉鸡称重，计算平均日饮水量、平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 粗蛋白质表观代谢率测定

在21、42日龄时，每个重复取1只鸡，按照Steenfeldt等[11]的试验方法进行代谢试验，收集3 d的粪样及饲粮样品，依据《饲料分析及饲料质量检测技术》[12]利用半自动凯氏定氮仪测定粗蛋白质含量，粗蛋白质表观代谢率计算公式如下：

粗蛋白质表观代谢率(%)=100×(饲粮中粗蛋白质含量-粪中粗蛋白质含量)/
饲粮中粗蛋白质含量。

1.3.3 肠道组织形态测定

在21、42日龄时，每个重复随机抓取1只肉鸡进行屠宰，分离出空肠、回肠，各取2 cm肠段，生理盐水冲洗后放入4%多聚甲醛中固定保存，进行石蜡切片制作，苏木精-伊红(HE)染色后在光学显微镜下对组织形态进行观察。利用CaseViewer 2.4图像处理系统对肠道绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度进行测量，利用绒毛高度和绒毛宽度计算绒毛表面积，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值(绒隐比，CD/VH)。

1.3.4 盲肠内容物菌群的Illumina高通量测序及盲肠活菌培养计数

在21、42日龄时，每个重复随机取1只肉鸡屠宰，无菌采取左侧盲肠内容物，液氮保存，送上海元华生物科技有限公司，利用Illumina测序系统对盲肠内容物菌群基因组DNA的16S rRNA V3～V4区进行高通量测序和生物信息学分析[13]。

同时，取0.5 g肠道内容物于1 mL无菌生理盐水中，37 ℃摇床中培养30 min，稀释到10-7～10-2，用平板计数法计算大肠杆菌、志贺氏菌、乳酸菌和双歧杆菌数量。大肠杆菌采用EMB培养基，志贺氏菌采用SS培养基，好氧培养24 h；乳酸菌采用LBS培养基，双歧杆菌采用TPY培养基，厌氧培养48 h。

1.4 统计分析

利用SPSS 20.0对试验数据进行统计分析，利用一般线性模型对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，数据以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡生长性能的影响

由表3可知，在1～21日龄，DW组平均日采食量和平均日饮水量显著低于CON组(P<0.05)，MIX组、OI组和DW组料重比显著低于CON组(P<0.05)。MIX组、OI组和DW组之间平均日采食量、平均日饮水量、平均日增重无显著差异(P>0.05)，MIX组、DW组料重比显著低于OI组(P<0.05)。

在22～42日龄，MIX组、OI组和DW组平均日增重显著高于CON组(P<0.05)，料重比显著低于CON组(P<0.05)。MIX组、OI组和DW组之间平均日采食量、平均日饮水量、平均日增重和料重比无显著差异(P>0.05)。

在1～42日龄，DW组和MIX组平均日增重显著高于CON组(P<0.05)，MIX组、OI组和DW组料重比显著低于CON组(P<0.05)。MIX组、OI组和DW组之间平均日采食量、平均日饮水量、平均日增重和料重比无显著差异(P>0.05)。

2.2 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡粗蛋白质表观代谢率的影响

由表4可知，21和42日龄时，MIX组、OI组和DW组粗蛋白质表观代谢率均显著高于CON组(P<0.05)。21日龄时，MIX组、OI组和DW组之间粗蛋白质表观代谢率差异不显著(P>0.05)；42日龄时，DW组粗蛋白质表观代谢率显著高于OI组(P<0.05)，与MIX组差异不显著(P>0.05)。

表4 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡粗蛋白质表观代谢率的影响

2.3 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡肠道形态的影响

由表5可知，21日龄时，在空肠中，MIX组、OI组和DW组绒毛高度、绒毛表面积和绒隐比均显著高于CON组(P<0.05)，隐窝深度显著低于CON组(P<0.05)。MIX组、OI组和DW组绒毛高度、绒毛表面积差异不显著(P>0.05)；DW组隐窝深度显著低于MIX组(P<0.05)，与OI组差异不显著(P>0.05)；DW组绒隐比显著高于OI组(P<0.05)，与MIX组差异不显著(P>0.05)。在回肠中，MIX组绒毛高度、绒毛表面积、绒隐比显著高于CON组(P<0.05)，隐窝深度显著低于CON组(P<0.05)；DW组绒毛表面积、绒隐比显著高于CON组(P<0.05)，隐窝深度显著低于CON组(P<0.05)。MIX组、OI组和DW组之间绒毛表面积、隐窝深度、绒隐比差异不显著(P>0.05)；DW组绒毛高度显著低于MIX组(P<0.05)，与OI组差异不显著(P>0.05)。

42日龄时，在空肠中，OI组和DW组绒毛高度、绒毛表面积显著高于CON组(P<0.05)；MIX组、OI组和DW组隐窝深度显著低于CON组(P<0.05)，绒隐比显著高于CON组(P<0.05)。DW组绒毛高度、绒隐比显著高于MIX组和OI组(P<0.05)，绒毛表面积显著高于MIX组(P<0.05)。在回肠中，MIX组、OI组和DW组绒毛高度和绒隐比显著高于CON组(P<0.05)，MIX组和DW组绒毛表面积显著高于CON组(P<0.05)，DW组隐窝深度显著低于CON组(P<0.05)。DW组绒毛高度、绒毛表面积、绒隐比显著高于MIX组和OI组(P<0.05)，MIX组、OI组和DW组之间隐窝深度差异不显著(P>0.05)。

表5 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡肠道形态的影响

2.4 乳酸菌不同饲喂方式对盲肠菌群的影响

由表6可知，21日龄时，各组操作分类单元(OTU)数量在465～692个，MIX组、OI组和DW组Chao指数和Shannon指数与CON组相比有所提高；42日龄时，各组OTU数量在557～650个，MIX组、OI组和DW组Chao指数和Shannon指数与CON组相比均有所提高，表明添加乳酸菌可提高菌落多样性和丰富度。各组样品的覆盖度(coverage)均在0.99以上，说明样品中序列已基本全部检测出。

在门水平上，各组优势菌群如图1所示。21日龄时，各组核心菌门为厚壁菌门、拟杆菌门；CON组厚壁菌门相对丰度最高，为88.37%，DW组拟杆菌门相对丰度最高，为25.50%。42日龄时，各组核心菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、无壁菌门等；CON组厚壁菌门、变形菌门、无壁菌门相对丰度较高，分别为88.37%、2.75%、2.68%，DW组拟杆菌门相对丰度最高，为25.50%。

表6 盲肠内容物16S rRNA测序结果

Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidete：拟杆菌门；Tenericutes：无壁菌门；Proteobacteria：变形菌门；Cyanobacteria：蓝细菌；Others：其他。

在属水平上，各组优势菌群如图2所示。21日龄时，各组盲肠菌群主要菌属为粪球菌属；CON组粪球菌属相对丰度为36.77%，MIX组为18.75%，OI组为18.91%，DW组为33.67%。毛螺菌科未分类属也为优势菌属，MIX组毛螺菌科未分类属相对丰度为12.34%，OI组为9.86%，DW组为12.76%。CON组粪球菌属、梭菌属相对丰度较高，分别为36.77%、6.08%。MIX组克里斯滕森菌科R-7群相对丰度最高，为16.12%。OI组令枝菌属、乳杆菌属相对丰度较高，分别为8.58%、4.58%。DW组毛螺菌科未分类属、瘤胃球菌科UCG-014相对丰度较高，分别为12.76%、9.07%。

42日龄时，CON组布劳特氏菌属、梭菌属、埃希氏菌属相对丰度较高，分别为11.20%、8.63%、8.10%。MIX组毛螺菌科未分类属、粪球菌属相对丰度较高，分别为15.49%、9.24%。OI组乳杆菌属、克里斯滕森菌科R-7群相对丰度较高，分别为8.34%、4.60%。DW组梭菌属、拟杆菌属、令枝菌属相对丰度较高，分别为28.65%、17.17%、6.90%。

Faecalibacterium：粪球菌属；Lachnospiraceae_unclassified：毛螺菌科未分类属；[Ruminococcus]_torques_group：链瘤胃球菌群；Clostridiales_vadinBB60_group_norank：梭菌属；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科UCG-014；Bacteroides：拟杆菌属；Ruminococcaceae_unclassified：瘤胃球科未分类属；Anaerotrunous：厌氧棍状菌属；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Alistpes：令枝菌属；Ruminococcaceae_uncultured：瘤胃球科未分类属；Blautia：布劳特氏菌；Eisenbergiella：艾森伯格氏菌属；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科UCG-005；[Eubacterium]_coprostanoligenes_group：真杆菌属；Lactobacillus：乳杆菌属；Clostridiales_unclassified：梭状芽胞杆菌未分类属；Lachnoclostridum：蓝绿藻菌属；Ruminiclostridium_9：瘤胃梭菌-9属；Butyricicoccus：丁酸球菌属；Tyzzerella：泰泽拉菌属；Erysipelatoclostridium：丹毒荚膜菌属；Anaerofilum：细杆菌属；Mollicutes_RF9_norank：柔膜细菌RF9属；Erysipelotrichaceae_unclassified：丹毒菌科未分类属；Flavonifractor：黄腐菌属；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136群；Escherichia-Shigella：埃希氏菌属；Odoribacter：内脏臭气杆菌；Subdoligranulum：罕见小球菌属；Sellimonas：肠道粪便单胞菌属；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌属；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科属UCG-010；Ruminococcus_1：链瘤胃球菌1属；Gastranaerophilates_norank：胃嗜气菌属。

由表7可知，21、42日龄时，MIX组、OI组和DW组盲肠双歧杆菌数量均显著高于CON组(P<0.05)，大肠杆菌数量显著低于CON组(P<0.05)。21日龄时，DW组盲肠乳酸菌、双歧杆菌数量显著高于MIX组和OI组(P<0.05)，志贺氏菌数量显著低于CON组、MIX组和OI组(P<0.05)，大肠杆菌数量显著低于MIX组(P<0.05)。42日龄时，DW组、OI组盲肠双歧杆菌数量显著高于MIX组(P<0.05)，大肠杆菌数量显著低于MIX组(P<0.05)。

表7 盲肠活菌计数结果

7Items GroupsCONMIXOIDWPP-value42 42 days of age Bifidobacterium7.98±0.02c8.43±0.02b9.27±0.02a9.30±0.01a0.026 Lactic acid bacteria7.84±0.04b9.14±0.01a9.08±0.02a9.01±0.02a0.043 Escherichia coli9.42±0.02a9.26±0.10b8.18±0.05c8.23±0.06c0.031 Shigellosis9.42±0.01a8.94±0.04b8.21±0.01c8.20±0.02c0.036

3 讨 论

3.1 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡生长性能和粗蛋白质表观代谢率的影响

很多研究认为，乳酸菌可附着于动物肠黏膜表面，改善肠道结构，提高消化酶活性，促进蛋白质等有机物的消化吸收，从而提高对饲粮的代谢及利用率，在肠道中可以起到良好的益生作用[14-16]。研究发现，乳酸菌可通过提高采食量而提高肉鸡生长性能[17-18]。本试验在1～21日龄时，DW组平均日采食量显著低于CON组，与OI组和MIX组差异不显著。产生差异的原因可能是乳酸菌可提高营养物质代谢率，进而降低采食量。因为有研究发现，饲喂肉鸡嗜酸乳杆菌可显著提高粗蛋白质表观代谢率[19]。本试验42日龄时，MIX组、OI组和DW组粗蛋白质表观代谢率和平均日增重均高于CON组，也证实了这种可能性。此外，菌株的繁殖能力、能否代谢活性物质及产生有机酸的不同，也可能对结果产生影响[20]。本研究发现，DW组和MIX组生长性能和粗蛋白质表观代谢率无显著差异，且均优于OI组，可能是在饲喂过程中口腔灌服会导致肉鸡应激，使其精神萎靡，采食量减少，饲料利用率降低[21]。

3.2 乳酸菌不同饲喂方式对肉鸡肠道健康的影响

肠道绒毛高度、隐窝深度和绒隐比是评价肠道功能的重要指标[22-23]。谷巍等[24]研究发现，乳酸菌通过增加肠道绒隐比以增强小鼠免疫力，降低小鼠腹泻率。肉鸡饲粮中添加乳酸菌，也可提高绒隐比，降低呕吐毒素污染饲粮对肉鸡的不良影响[25]。本研究中，以饮水方式饲喂乳酸菌菌液，肉鸡小肠绒毛表面积、绒隐比显著高于其他饲喂方式。分析其原因可能为：虽然本试验设计初为各组提供了等量乳酸菌，但受肉鸡采食习性影响(漏料、滴水等)，加之拌料后菌种活菌数与菌液直接保存也存在细微差异，导致各组肉鸡每日实际摄入活菌数量存在一定差异，影响饲喂效果。其中，以饮水方式饲喂乳酸菌菌液可保证菌液混合均匀，减少误差，避免肉鸡应激，提高乳酸菌饲喂效果。

乳酸菌在肠道内增殖，代谢出乳酸，抑制致病菌的增殖，调节肠道菌群平衡[26]。本研究发现，肉鸡盲肠菌群在门水平上主要有厚壁菌门、拟杆菌门、无壁菌门、变形菌门，在属水平上主要有粪球菌属、拟杆菌属，与前人研究结果[27-28]一致。研究发现，厚壁菌门和拟杆菌门存在着共生关系，可共同促进宿主吸收或储存能量，若比例过高会导致宿主产生代谢综合征[29]。本试验发现，饲喂乳酸菌能降低厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度，促进肉鸡健康。

本试验发现，在属水平上，MIX组、OI组和DW组大肠杆菌、志贺氏菌等致病菌属相对丰度均低于CON组，与刘凤美等[30]研究结果一致。其中，以饮水方式饲喂乳酸菌菌液能显著降低有害菌数量。DW组瘤胃球菌科UCG-014相对丰度最高，其主要发酵产物为乙酸、甲酸，可以降低肠道pH，减少有害菌的增殖[31]。有报道表明，小鼠肠道菌群在乳酸菌干预后，乳杆菌属丰富度显著增加[32]。本试验中，不同方式饲喂乳酸菌均可增加盲肠乳杆菌属相对丰度，其中OI组、DW组盲肠乳杆菌属相对丰度较高，与活菌计数结果相一致。

4 结 论

本试验条件下，3种乳酸菌饲喂方式均可不同程度提高肉鸡生长性能和粗蛋白质表观代谢率，改善肠道形态和肠道菌群结构，增加有益菌数量，降低有害菌数量，其中以饮水方式饲喂效果更佳。