超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法分析金水六君煎化学成分*

李红亮，金思岑

（重庆太极实业<集团>股份有限公司，重庆 401123）

金水六君煎见于明代张介宾的《景岳全书》，被列为国家中医药管理局协同国家药品监督管理局公布的《古代经典名方目录（第一批）》第58首［1］，由当归、熟地黄、陈皮、半夏、茯苓、炙甘草、生姜7味药材组方，主治肺肾虚寒、水泛为痰，或年迈阴虚、血气不足、外受风寒、咳嗽呕恶、喘逆多痰等症［2］。近年来对该方的药效学研究较多，但对其化学成分的研究仅停留在单个或多个成分的含量测定方法及多成分的高效液相色谱指纹图谱研究［3-5］，而经典名方中物质组分的全面分析是制订其质量标准的基础［6］。为更好地控制金水六君煎的质量，需对其化学成分进行全面研究。超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）法能快速识别中药复方中的化学成分，且分辨率和灵敏度均较高，广泛应用于中药复方的组分分析［7-8］。本研究中建立了分析金水六君煎中主要化学成分的UPLC-Q-Orbitrap HRMS法，进一步明确了该煎剂的物质基础，为后续的质量属性研究提供了数据支持。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Vanquish型UPLC-Q-Orbitrap HRMS仪（美 国Thermo Scientific公司）；XSE205DU型十万分之一电子天平、AE240型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

金水六君煎（公司自制）；甘草苷对照品（批号为111610-201908，含量95.0%），橙皮苷对照品（批号为110721-201818，含量96.2%），柚皮苷对照品（批号为110722-201815，含量91.7%），6-姜辣素对照品（批号为111833-201806，含量93.6%），腺苷对照品（批号为110879-201703，含量99.7%），藁本内酯对照品（批号为111737-201910），阿魏酸对照品（批号为110773-201614，含量99.0%），异阿魏酸对照品（批号为111698-201904，含量99.3%），滨蒿内酯对照品（批号为111511-201704，含量99.9%），均购自中国食品药品检定研究院；异甘草苷对照品（成都昂赛思生物科技有限公司，批号为5041-81-6，含量≥98.0%）；洋川芎内酯A对照品（成都普菲生物技术有限公司，批号为17051901，含量≥98.0%）。乙腈、甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为ThermoScientificAccucoreTMC18柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～23 min时30%B→95%B，23～25 min时95%B，25～30 min时95%B→30%B）；流速为0.3 mL/min；柱温为30℃；进样量为3 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式为正、负离子全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/dd-MS2）；离子源温度为350℃；鞘气为氮气，流速为35 arb；辅助气为氮气，流速为10 arb；离子传输管温度为320℃；喷雾电压为3.2 kV。一级质谱扫描分辨率［以半峰全宽（FWHM）计］为70 000 FWHM；二级分辨率为17 500 FWHM；扫描范围质荷比（m/z）100～1 500；碰撞能量梯度为20，40，60 eV。

2.2 溶液制备

取甘草苷、异甘草苷、橙皮苷、柚皮苷、6-姜辣素、腺苷、藁本内酯、阿魏酸、异阿魏酸、洋川芎内酯A、滨蒿内酯对照品各适量，精密称定，加甲醇制成上述成分质量 浓 度 分 别 为11.5，10.3，11.2，10.2，10.3，10.1，51.2，10.4，9.7，50.7，50.5 μg/mL的混合对照品溶液。取样品5 mL，减压回收溶剂，蒸干，加水20 mL，溶解，加40 mL乙酸乙酯萃取1次，回收溶剂，加甲醇溶解，置5 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 检测结果

取2.2项下2种溶液各适量，按2.1项下试验条件进样测定，记录色谱图（见图1），总离子流图（TIC）见图2。利用Compound Discoverer 3.0软件对原始数据进行峰对齐和峰提取，通过与mzCloud质谱数据库及mzVault网络数据库进行匹配，并与相关文献进行对比以及与对照品进行确认，共鉴定63个化学成分，包括黄酮类22个、生物碱类9个、内酯类6个、芳香族类6个、有机酸类5个、香豆素类3个、氨基酸类4个、核苷酸类2个、糖类2个及其他类4个。具体成分信息见表1。

表1 金水六君煎化学成分信息Tab.1 Characterization of chemical components of Jinshuiliujun Decoction

图1 高效液相色谱图1.Adenosine 2.Ferulic acid 3.Liquiritin 4.Naringin 5.Isoferulic acid 6.Hesperidin 7.Isoliquiritin 8.Scoparone 9.Ligustrolide A 10.6-Gingerol 11.Ligustilide A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

图2 总离子流图A.Positive ion B.Negative ionFig.2 Total ion flow chromatogram

续表1金水六君煎化学成分信息Continued Tab.1 Characterization of chemical components of Jinshuiliujun Decoction

2.4 成分鉴定与分析

黄酮类化合物：共鉴定出22种，分别为化合物17～18，22～23，27～29，31～34，36，38～39，41，45，47～48，54，56，58，61。以化合物29橙皮苷为例，根据保留时间10.32 min，及在正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z611.197 33，推测其分子式为C28H34O15；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z303.086 40，分析其为准分子离子丢失C12H20O9形成的碎片；根据碎片离子峰（2）m/z177.054 82和（3）m/z153.018 40，分析其为碎片离子峰（1）裂解形成的2个碎片离子峰。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为橙皮苷，最后经与对照品比对确定。质谱裂解途径见图3。

图3 橙皮苷质谱裂解途径Fig.3 MS fragmentation pathway of hesperdin

生物碱类化合物：共鉴定出9种，分别为化合物2～3，7，9，12，14，44，62～63。以化合物9烟碱为例，根据保留时间2.75 min，及正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z123.055 63，推测其分子式为C6H6N2O；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z106.029 47，分析其为准分子离子丢失—NH3形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z78.034 72，分析其为碎片离子峰（1）丢失—CO—形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为烟碱。质谱裂解途径见图4。

图4 烟碱质谱裂解途径Fig.4 MS fragmentation pathway of nicotinic

内酯类化合物：共鉴定出6种，分别为化合物20，40，49～51，57。以化合物20黑麦草内酯为例，根据保留时间9.61 min，及正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z197.117 65，推测其分子式为C11H16O3；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z179.106 86，分析其为准分子离子丢失H2O后形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z161.096 24，分析其为由碎片离子峰（1）丢失H2O形成的碎片；根据碎片离子峰（3）的m/z133.101 41，分析其为碎片离子峰（2）丢失—CO—形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为黑麦草内酯。质谱裂解途径见图5。

图5 黑麦草内酯质谱裂解途径Fig.5 MS fragmentation pathway of loliolide

香豆素类化合物：共鉴定出3种，分别为化合物16，26，42。以化合物26滨蒿内酯为例，根据保留时间10.07 min，及在正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z207.065 19，推测其分子式为C11H10O4；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z192.041 72，分析其为准分子离子丢失—CH3形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z179.040 16，分析其为准分子离子丢失—CO—形成的碎片；根据碎片离子峰（3）的m/z151.075 36，分析其为准分子离子丢失2个—CO—形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为滨蒿内酯，最后经与对照品比对确定。质谱裂解途径见图6。

图6 滨蒿内酯质谱裂解途径Fig.6 MS fragmentation pathway of scoparone

芳香族类化合物：共鉴定出6种，分别为化合物13，30，46，55，59～60。以化合物55（4-甲氧基苯甲醛）为例，根据保留时间18.89 min，及在正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z137.059 84，推测其分子式为C8H8O2；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z122.036 51，分析其为准分子离子丢失—CH3形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z94.04186，分析其为碎片离子（1）丢失—CO—形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为4-甲氧基苯甲醛。质谱裂解途径见图7。

图7 4-甲氧基苯甲醛质谱裂解途径Fig.7 MS fragmentation pathway of 4-methoxy benzaldehyde

有机酸类化合物：共鉴定出5种，分别为化合物19，25，35，37，53。以化合物25阿魏酸为例，根据保留时间9.95 min及在负离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z193.050 13，推测其分子式为C10H10O4；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z178.026 60，分析其为准分子离子丢失—CH3形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z149.060 09，分析其为准分子离子丢失CO2后形成的碎片；根据碎片离子峰（3）的m/z134.036 48，分析其为碎片离子（2）丢失—CH3形成的碎片；根据碎片离子峰（4）的m/z123.044 78，分析其是由碎片离子（2）丢失C2H2形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为阿魏酸，最后经与对照品比对确定。质谱裂解途径见图8。

图8 阿魏酸质谱裂解途径Fig.8 MS fragmentation pathway of ferulic acid

氨基酸类化合物：共鉴定出4种，分别为化合物1，10，15，21。以化合物1精氨酸为例，根据保留时间1.74 min及在正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z175.118 90，推测其分子式为C6H14N4O2；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z158.092 32，分析其为准分子离子丢失-NH3形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z130.097 6，分析其为准分子离子丢失—COOH后形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为精氨酸。质谱裂解途径见图9。

图9 精氨酸质谱裂解途径Fig.9 MS fragmentation pathway of arginine

核苷酸类化合物：共鉴定出2种，分别为化合物4，8。以化合物8腺苷为例，根据保留时间2.41 min，及正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z268.103 91，推测其分子式为C10H13N5O4；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰（1）的m/z136.061 17，分析其为准分子离子丢失C5H8O4形成的碎片；根据碎片离子峰（2）的m/z119.035 3，分析其为碎片离子（1）丢失—NH3形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为腺苷，最后经与对照品比对确定。质谱裂解途径见图10。

图10 腺苷质谱裂解途径Fig.10 MS fragmentation pathway of adenosine

糖类化合物：共鉴定出2种，分别为化合物5和6。以化合物6蔗糖为例，根据保留时间2.23 min，及在正离子模式下一级质谱信息中其准分子离子峰的m/z341.109 70，推测其分子式为C12H22O11；进一步进行二级质谱扫描，根据碎片离子峰的m/z179.055 5，分析其为准分子离子丢失C6H10O5形成的碎片。根据其二级质谱裂解方式，检索mzCloud和mzVault网络数据库，推测为蔗糖。质谱裂解途径见图11。

图11 蔗糖质谱裂解途径Fig.11 MS fragmentation pathway of sucrose

其他类化合物：共鉴定出4种其他类化合物，分别为化合物11，24，43，52。

3 讨论

本研究中采用了正、负离子同时扫描的方法对金水六君煎中的化合物进行检测，在此基础上根据色谱峰分离情况优化色谱条件及样品提取条件，流动相考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，发现以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液为流动相时，色谱峰分离效果较好，故选用。

本研究中鉴定出金水六君煎物质基准中63个化学成分，通过查阅文献对这些成分的来源进行分析，发现黄酮类成分多来源于甘草和陈皮，生物碱类成分多来源于半夏，酚酸类成分多来源于生姜，内酯和苯丙素类成分多来源于当归，氨基酸类成分多来源于半夏和茯苓。本研究中对金水六君煎的化学成分进行了较全面的研究，为其物质基础、入血成分及其代谢物的研究奠定了基础。

本研究还存在一定不足，尚有很多化合物未鉴定出来，包括某些药材的代表性成分，如熟地黄的毛蕊花糖苷、梓醇及地黄苷D等，可能是由于供试品制备时仅采用乙酸乙酯萃取，导致样品中化学成分提取不完全。后续可通过优化样品制备条件，或采用多个不同极性的有机溶剂对样品进行萃取，并对每个组分都进行鉴别。而对于其他未鉴定出的化学成分仍待更深入的研究。

本研究中有11个化学成分通过与对照品比对而准确鉴定，以此为基础，建立了同时测定金水六君煎中11种主要成分的UPLC法［3］，从而对金水六君煎的物质基础及现代制剂质量进行控制与评价，为相关新药开发奠定了坚实的基础。