高效液相色谱法测定过氧化碳酰胺中枸橼酸含量

林新文，唐闪光，武欣倩，朱光冕，李 颖，海 乐

（1.湖南省药品审核查验中心，湖南 长沙 410001；2.湖南一格制药有限公司，湖南 湘潭 411100）

过氧化碳酰胺是尿素与过氧化氢以氢键结合形成的配合物，临床常用作静脉给氧药物，可治疗因缺氧所致各种急重症［1］。由于过氧化氢属极弱酸（Ka=2.4×10-12），在碱性条件下易分解［2］，故需添加适量的pH调节剂稳定其性质。枸橼酸又名柠檬酸，属大分子有机酸，为药物制剂中常用的pH调节剂，具有良好的理化特性。其添加量在药典中未明确限定，可按实际生产需要量添加，但为了更好地确保临床用药的安全有效，采用准确的测定方法，对于了解不同药品中枸橼酸的含量及对枸橼酸加入量的控制有重要意义。目前枸橼酸常用测定方法有高效液相色谱（HPLC）法、紫外-可见分光光度法、离子色谱法、气相色谱法等［3-5］。其中，紫外-可见分光光度法的灵敏度较低，离子色谱法和气相色谱法成本较高且操作较烦琐。为此，本研究中采用HPLC法测定过氧化碳酰胺中枸橼酸的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；MA105DU型电子天平（德国Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；Evolution 220型紫外-可见分光光度计（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 试药

过氧化碳酰胺（批号分别为20191019，20191006，20191016）；枸橼酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100396-201503，含量100%，规格为每支200 mg）；乙腈为色谱纯，磷酸二氢铵为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢铵（A）-乙腈（以三乙胺调pH至7.0，B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：0.7 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：25℃；进样量：20 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase

2.2 溶液制备

取枸橼酸对照品25.28 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用流动相A溶解并定容，作为对照品贮备液；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相A定容，混匀，即得对照品溶液。取过氧化碳酰胺样品1.00 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，用流动相A定容，混匀，即得供试品溶液。以流动相A作为空白对照溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性与专属性试验：取2.2项下3种溶液各20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液与对照品溶液色谱在相同保留时间处有相应色谱峰，理论板数以枸橼酸峰计为14 514（>2 000），枸橼酸峰拖尾因子为1.0（≤1.5），各成分基线分离良好，且阴性对照无干扰，表明专属性好。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Citric acidA.Reference solution B.Test solution C.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取对照品贮备液0.2，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相A定容，制成质量浓度为10.11，50.56，101.12，202.24，404.48 μg/mL的系列对照品溶液。精密量取20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定。以枸橼酸质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=2.19×106X+4.57×103（r=0.998 0，n=5）。结果表明，枸橼酸质量浓度在10.11～404.48 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限考察：精密量取2.2项下对照品溶液0.1 mL，加流动相A稀释至200 mL，按2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比为10∶1、3∶1时的待测成分质量浓度分别记作定量限及检测限。结果枸橼酸定量限及检测限分别为0.05 μg/mL及0.01 μg/mL。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果枸橼酸峰面积的RSD为0.78%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8 h，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果枸橼酸峰面积的RSD为1.10%（n=5），表明供试品溶液在室温放置8 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号20191006）适量，各6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果枸橼酸峰面积的RSD为0.64%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（批号20191006）适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的枸橼酸对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 耐用性试验

称取样品适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件（分别设置流速为0.56，0.70，0.84 mL/min）进样测定，记录峰面积；取样品适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件（分别设置流动相pH为5.6，7.0，8.4）进样测定，记录峰面积。结果见表3。可见，流动相或其流速发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

表3 耐用性试验结果Tab.3 Results of the durability test

2.5 样品含量测定

取3批样品各适量，各批平行测定2次，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表4。

表4 枸橼酸含量测定结果（n=2）Tab.4 Results of content determination of citric acid in samples（n=2）

3 讨论

现有研究对枸橼酸含量的检测主要集中于食品、饮料和饲料［6-11］，对于药品中枸橼酸的含量检测报道较少。预试验中，取0.04 mg/mL过氧化碳酰胺溶液和0.50 mg/mL枸橼酸对照品溶液进行紫外光谱（190～260 nm波长）扫描，定性检测。结果过氧化碳酰胺和枸橼酸在190～240 nm波长范围中存在末端吸收，随着波长的增加，吸收逐渐减少，结合已有文献［12-14］，选择210 nm作为检测波长。参考相关文献［15］，选择以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢铵作为流动相，并对流速等相关条件进行了优化。结果表明，在优化后的色谱条件下，主要成分枸橼酸与相邻成分的色谱峰分离度良好。

综上所述，本研究中建立了一种符合药典相关要求，适用于药品生产企业相关检测，能有效测定过氧化碳酰胺中枸橼酸含量的方法，并对每个参数设立了可以接受的标准和验证步骤。过氧化碳酰胺中枸橼酸的含量测定，可为药品中pH调节剂添加量的有效性和安全性提供保障。