溶酶体靶向吲哚氟硼二吡咯光敏剂的合成、双光子荧光成像及光动力治疗

刘苗，刘瑞波，刘巴蒂，钱鹰

（东南大学化学化工学院,南京 211189）

在光激发下，光敏染料通过光控能量转移的方式产生具有细胞毒性的单线态氧，诱导肿瘤细胞凋亡、坏死，实现肿瘤细胞的光动力治疗（PDT）.光动力治疗具有选择性好、耐药性强、暗毒性低以及可协同治疗等优势，在恶性肿瘤治疗领域中具有重要的应用潜力［1～6］.近红外双光子激发的光敏剂具有生物损伤小、组织深部光透性强、自身荧光干扰弱和时空选择性高的优势，能有效地杀死肿瘤细胞［7，8］.因此，设计和合成双光子光敏染料具有重要意义.另一方面，光敏染料产生的单线态氧存在寿命短（＜5 s）、扩散范围小（＜200 nm）的不足，只能在光敏剂富集的区域发生作用［9～12］.由此可知，具有细胞器靶向的光敏剂可以提高对恶性肿瘤治疗的靶向性.溶酶体内含多种水解酶，是细胞的消化中心.快速增长、分裂的肿瘤细胞为了可以应对微环境的改变和保证足够的营养物质，需要溶酶体的降解功能，破坏溶酶体膜结构会导致肿瘤细胞凋亡或坏死.因此，引入多个溶酶体靶向基团可以实现精准的光动力治疗［13～16］.目前文献报道的光敏剂主要包括卟啉类、花菁类、萘酰亚胺类、罗丹明类以及氟硼二吡咯类［17～22］.然而，这些光敏剂存在发射波长较短、单线态氧效率低及肿瘤靶向性差等缺陷.综上所述，设计和合成具有溶酶体靶向的近红外光敏剂用于双光子荧光成像及光动力治疗具有重要的意义和价值.

本课题组［23～29］近期报道了一系列化合物用于光动力治疗研究.以氟硼二吡咯（BODIPY）为母核，设计合成了基于自旋轨道电荷转移-系间窜越（SOCT-ISC）机制的光敏剂［23，24］；报道了噻吩-氟硼二吡咯双光子光敏染料，用于双光子荧光成像及肿瘤细胞的光动力治疗［25］；首次将荧光蛋白生色团类似物应用于光动力治疗，设计合成了吩噻嗪-荧光蛋白类双光子光敏染料［26～28］；报道了一种基于荧光共振能量转移的七甲川菁光敏剂，用于A549细胞的光动力治疗和双光子荧光成像［29］.在前期工作基础上，结合BODIPY染料具有摩尔消光系数大、荧光量子产率高、光稳定性好以及荧光发射峰窄等优点［30～33］，本文设计合成了一个具有溶酶体靶向的近红外光敏剂IMBDP-Lys，用于双光子荧光成像及光动力治疗（Scheme 1）.该光敏剂是通过“一锅法”和Knoevenagel缩合反应引入吲哚吗啉功能团到BODIPY的8-位和3-位构筑而成.3-位和8-位的2个吗啉基团提高了光敏剂对溶酶体的靶向能力和生物相容性，共轭连接使光敏剂吸收与发射波长均发生红移.测定了光敏剂IMBDP-Lys在二氯甲烷溶液中的紫外-可见吸收光谱、荧光量子产率及单线态氧量子产率.此外，将该光敏剂成功应用于斑马鱼的双光子荧光成像和A549肿瘤细胞的光动力治疗研究.

Scheme 1 Structure of photosensitizer IMBDP-Lys and its application in two-photon fluorescence imaging and photodynamic therapy

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

吲哚-3-甲醛，分析纯，阿拉丁试剂有限公司；N-（2-氯乙基）吗啉盐酸盐，分析纯，上海毕得医药科技有限公司；N-碘代丁二酰亚胺（NIS），分析纯，Sigma Aldrich公司；细胞毒性实验用溴化噻唑蓝四氮唑（MTT），上海碧云天生物技术有限公司；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、无水乙醇和甲苯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司.

AvanceⅢHD 600 Hz型核磁共振光谱仪（NMR），瑞士Bruker公司；Ultraflex II型（MALDI-TOF）高分辨质谱仪（HRMS），瑞士Bruker公司；UV-3600型紫外-可见光谱仪（UV-Vis），日本岛津公司；FluoroMax-4型荧光光谱仪，日本崛场公司；Fluoviewfv 3000型共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），奥林巴斯公司；FV1000MPE型双光子荧光显微镜，奥林巴斯公司.

1.2 实验过程

1.2.1 光敏剂IMBDP-Lys的合成参照文献［34～36］方法制备中间体BDP和IMBDP，光敏剂IMBDPLys的合成路线如Scheme 2所示.

Scheme 2 Synthetic route of photosensitizer IMBDP-Lys

在N2气保护下，将218.4 mg（0.3 mmol）IMBDP和92.9 mg（0.4 mmol）1-（2-吗啉代乙基）1H-吲哚-3-甲醛溶于20.0 mL甲苯中，搅拌均匀后，加入20.0 μL催化剂哌啶和20.0 μL冰醋酸.将上述混合液在110℃下搅拌反应，利用薄层色谱跟踪反应进程.反应结束后，用二氯甲烷和水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，经旋转蒸发抽干多余溶剂，用闪式柱层析纯化得到IMBDP-Lys深绿色固体，产率为38%.1HNMR（600 MHz，CDCl3），δ：8.52（d，J=7.5 Hz，2H），8.23（d，J=7.8 Hz，2H），7.88（d，J=16.6 Hz，2H），7.56（s，2H），7.32（d，J=7.3 Hz，2H），7.17（t，J=7.5 Hz，1H），7.05（s，1H），4.37～4.30（m，4H），3.73（s，8H），2.81（s，6H），2.55（s，12H），1.49（s，3H）.C42H45BF2I2N6O2HRMS实测值（理论值），m/z：969.1859（969.1827）［M+H］+.

1.2.2 光动力治疗实验 实验中采用1640不完全培养基和10%胎牛血清的培养液培养A549细胞，于37℃，5%（体积分数）CO2的孵育箱中培养.通过MTT实验测定了细胞的暗毒性和光毒性.用含有光敏剂的新鲜培养基分别孵育A549细胞和斑马鱼1 h，可得到斑马鱼的双光子荧光成像和细胞成像.将商用溶酶体绿色染料Lyso-Tracker Green与含有光敏剂的A549细胞共孵育30 min，溶酶体共定位成像在共聚焦激光扫描显微镜下进行（Lyso-Tracker Green：λex=488 nm，λem=515～545 nm）.采用活性氧荧光探针DCFH-DA测试了细胞内活性氧含量［CLSM，2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）：λex=488 nm，λem=488～520 nm］.在黑暗环境中用吖啶橙（AO）和溴化乙锭（EB）染料进行AO/EB双染色实验，研究了肿瘤细胞的凋亡过程.采用细胞迁移实验探究了光敏剂抑制肿瘤细胞的能力.

2 结果与讨论

2.1 双吲哚吗啉取代的近红外光敏剂IMBDP-Lys的设计与理论计算

实验中选择BODIPY染料作为荧光母核，通过“一锅法”、Knoevenagel缩合反应引入吲哚吗啉基团到BODIPY染料的3-位和8-位，构筑了一种双吲哚吗啉取代、红光发射的光敏剂IMBDP-Lys.光敏剂3-位，8-位的2个吗啉基团不仅强化了对溶酶体的靶向能力，还改善了光敏剂的水溶性.此外，吲哚吗啉基团的共轭连接使光敏剂吸收与发射波长均发生红移，可以应用于双光子荧光成像和光动力治疗.中间体IMBDP和目标产物IMBDP-Lys均采用1HNMR和HRMS进行了表征，所得谱图见本文支持信息图S1～图S5.

双吲哚吗啉取代的近红外光敏染料IMBDP-Lys具有较强的系间窜越（ISC）能力，可显著提升单线态氧效率.采用高斯09W理论计算了光敏剂IMBDP-Lys的系间窜越过程.基于DFT/CAM-B3LYP/6-31G（d）/LANL2DZ方法优化了光敏剂IMBDP-Lys染料的几何构型，基于TD-DFT/CAM-B3LYP/TD-DFT//B3LYP/6-31g（d）/LANL2DZ方法，用TD-DFT预测了光敏剂IMBDP-Lys的单重态和三重态激发能，计算结果列于本文支持信息表S1.由图1可见，IMBDP-Lys光敏剂的S0→S1和S0→T1跃迁过程由最高占据分子轨道（HOMO）→最低未占据分子轨道（LUMO）主导，T2态由HOMO-1→LUMO主导.光敏剂S1态的能量值（2.52 eV）远高于T1态（1.07 eV），而略高于T2态（2.40 eV），由此可知，S1与T2态之间的能量差较小（0.12 eV），可以发生系间窜越.另一方面，T2态通过内转换（IC）至T1态产生的能量值大于三重态氧（3O2）转化为单重态氧（1O2）所需的能量值（0.98 eV）.由理论计算结果预测，双吲哚吗啉取代的近红外光敏染料IMBDP-Lys可通过系间窜越产生单线态氧.

Fig.1 Energy and frontier molecular orbital diagrams of photosensitizer IMBDP-Lys obtained with TD-DFT/CAM-B3LYP/TD-DFT//B3LYP/6-31g(d)/LANL2DZ level based on the optimized ground state geometries at DFT/CAM-B3LYP/6-31G(d)/LANL2DZ level basis set

2.2 IMBDP-Lys光敏剂在660 nm光作用下的单线态氧产率

图2（A）给出光敏剂IMBDP-Lys的紫外-可见光谱和荧光光谱，最大吸收波长为631 nm（摩尔消光系数为6.8×104L·mol-1·cm-1），发射波长为684 nm.以吲哚菁绿为参比，荧光量子产率为9.7%.

光敏剂IMBDP-Lys的单线态氧量子效率用参比法进行测试，以亚甲基蓝为参比，1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）为单线态氧捕获剂.由图2（B）可见，用660 nm的灯照射9.59 s后，IMBDP-Lys光敏剂能使DPBF的吸光度逐渐降低，经计算其单线态氧效率为48.3%.同时，光敏剂自身主吸收峰处吸光度几乎保持不变，表明光敏剂有良好的光稳定性.由上述结果可知，光敏剂在660 nm光照下可以产生单线态氧并且在红光区有良好的光稳定性.光敏剂IMBDP-Lys在二氯甲烷溶液中紫外吸收波长、发射波长、摩尔消光系数以及荧光量子产率和单线态产率的数据见表1.

Fig.2 Absorbance spectrum and fluorescence spectrum of photosensitizer IMBDP-Lys(1×10-5 mol/L)in CH2Cl2(A)and absorbance decrease at 414 nm of DPBF with photosensitizer IMBDP-Lys under 660 nm irradiation(B)

Table 1 UV absorption,emission wavelength,molar absorption coefficient,ΦF and ΦΔof PS IMBDP-Lys

2.3 IMBDP-Lys光敏剂用于双光子荧光成像

双光子吸收具有组织穿透性强、生物损伤小、光漂白小及空间选择性强的特点，可实现深层组织的高分辨荧光成像，为光动力治疗提供指导.将斑马鱼胚胎经培养液孵育成幼苗，与光敏剂IMBDPLys共孵育1 h后，用900 nm的飞秒激光对光敏剂进行双光子荧光成像.由图3可见，斑马鱼的头部、身体以及尾部呈现清晰明亮的红色荧光.光敏剂IMBDP-Lys可以在近红外激光激发下产生双光子上转换荧光，在双光子激发光动力治疗方面具有重要的应用潜力.

Fig.3 Two-photon imaging of the photosensitizer IMBDP-Lys(2 μmol/L)in zebrafish(λex=900 nm)

对光敏剂IMBDP-Lys进行了单光子荧光成像.将A549细胞在含有2 μmol/L光敏剂IMBDP-Lys的培养基中孵育30 min，用CLSM进行成像拍摄.由图4可见，光敏剂IMBDP-Lys能迅速进入细胞内，并呈现出红色荧光，由此可知光敏剂MBDP-Lys具有良好的生物相容性.

Fig.4 Single-photon imaging of the photosensitizer IMBDP-Lys(2 μmol/L)in A549 cells

光敏剂产生的活性氧存在寿命短、扩散范围小的不足，具有亚细胞器靶向的光敏剂产生的活性氧有更好的光动力效果.本文引入了2个溶酶体靶向功能团——吗啉，含有光敏剂IMBDP-Lys的细胞与商用溶酶体染料Lyso-Tracker Green共孵育进行溶酶体共定位成像.由图5可见，商业溶酶体染料发出的绿色荧光和光敏剂IMBDP-Lys展现的红色荧光重叠效果较好，经计算共定位系数高达0.95.上述结果表明，光敏剂IMBDP-Lys具有良好的溶酶体共定位能力.

Fig.5 Lysosome co-localization image of photosensitizers IMBDP-Lys(1 μmol/L)and Lyso-Tracker Green(1 μmol/L)

2.4 IMBDP-Lys光敏剂在A549细胞中的光动力治疗研究

采用MTT法测定了光敏剂IMBDP-Lys对A549细胞的毒性.由图6可见，在黑暗环境中，细胞与光敏剂IMBDP-Lys孵育24 h后细胞存活率超过85%，这表明光敏剂IMBDP-Lys在黑暗中对细胞的生存能力影响较小，具有较低的暗毒性.相反，在光照条件下，细胞存活率显著降低，且随着光敏剂IMBDP-Lys浓度和光照时间的增加，细胞存活率不断下降.在660 nm近红外光分别照射10和30 min后，A549细胞的最大半数抑制浓度（IC50）值分别为1.85和0.52 μmol/L.上述结果表明，光敏剂IMBDP-Lys具有低的暗毒性和高的光毒性.

采用活性氧荧光探针DCFH-DA探究了光敏剂产生活性氧的能力，细胞内产生的单线态氧可以使无荧光的DCFH转变成有绿色荧光的2’，7’-二氯荧光素（DCF）.由图7可见，在黑暗条件下，光敏剂IMBDP-Lys与A549细胞孵育24 h，加入DCFH-DA染料后细胞只显示了光敏剂本身的红色荧光，由此可知，黑暗条件下光敏剂未产生活性氧.但用660 nm的光照细胞5 min后，细胞内出现了绿色荧光，表明光敏剂在光照下可以产生活性氧.类似地，光敏剂IMBDP-Lys在斑马鱼内也有上述相同的实验现象.由此说明近红外光照下光敏剂IMBDP-Lys在细胞和斑马鱼体内均可以产生活性氧.

采用AO和EB进行活/死细胞染色实验，探究了光敏剂对A549细胞的凋亡过程.AO具有膜通透性，可以使活细胞核DNA和RNA染成绿色，EB仅能透过膜受损的细胞，嵌入核DNA并发出红色荧光，因此通过荧光可以区分细胞的存活状态.由图8（A）可见，无光照条件下，Group a细胞显示出均匀的绿色荧光.在660 nm光照Group b细胞5 min后，Group b细胞发出的绿色荧光减少，并且EB染料通道出现红色荧光.上述现象表明，光敏剂在660 nm光照下可以使肿瘤细胞发生凋亡或坏死.

Fig.6 Cell viability of different concentrations of photosensitizer IMBDP-Lys under 660 nm illumination for 0,10 and 30 min

Fig.7 Imaging of ROS with photosensitizer IMBDP-Lys

Fig.8 Photodynamic therapy with photosensitizers IMBDP-Lys in A549 cell

通过细胞迁移实验探究了光敏剂对肿瘤细胞的抑制能力.由图8（B）可见，含有光敏剂IMBDP-Lys（1 μmol/L）的细胞在无光照下其生长不受限制，划痕逐渐愈合.这表明光敏剂IMBDP-Lys在黑暗条件下对细胞的毒性极低，不会对细胞的生长和增殖产生负面影响.然而，在用660 nm的灯照射细胞5 min后，细胞的迁移被显著抑制，即使在孵育48 h后迁移也几乎无变化.由此可知，光敏剂IBDP-Lys在660 nm的光照下能有效抑制肿瘤细胞的迁移.

本文设计合成了一个双溶酶体靶向的近红外光敏剂IMBDP-Lys，该光敏剂具有单线态氧效率高、生物相容性好及精准靶向溶酶体的性质，成功应用于双光子荧光成像和光动力治疗.3-位和8-位的2个吗啉基团强化了对溶酶体的定位能力，与溶酶体商业染料共定位系数为0.95.此外，用900 nm飞秒激光对光敏剂IMBDP-Lys进行了双光子荧光成像，光敏剂能够快速进入斑马鱼体内并显示出清晰的红色荧光.用660 nm光照射光敏剂可以产生单线态氧诱导A549细胞凋亡，具有良好的模拟光动力治疗效果.因此，光敏剂IMBDP-Lys有望为双光子荧光成像和光动治疗打下基础.

3 结 论

设计合成了一种双溶酶体靶向、红光发射的光敏染料IMBDP-Lys，应用于双光子荧光成像和肿瘤细胞中的光动力治疗.选择具有优异光物理性质的吲哚吗啉-BODIPY荧光染料作为荧光母核，通过Knoevenagel缩合反应引入吲哚吗啉基团共轭连接到吲哚-BODIPY染料的3位，构筑了一种结构新颖、双吲哚吗啉取代的近红外光敏染料IMBDP-Lys.采用高斯09W软件计算了光敏剂的S1与T2态之间的能量差为0.12 eV，可以有效地发生系间窜越从而提高单线态氧的效率.此外，光敏剂IMBDP-Lys中3-位和8-位的2个吗啉基团可以强化对溶酶体的靶向能力，改善光动力治疗效果.在二氯甲烷溶液中，光敏剂IMBDP-Lys的最大吸收波长为631 nm，最大发射波长为684 nm.在660 nm光照射下，以亚甲蓝为参比，光敏剂IMBDP-Lys的单线态氧产率高达48.3%.在体外细胞实验中，含有2个吲哚吗啉基团的光敏剂具有良好的细胞相容性和精准的溶酶体靶向性；用900 nm的飞秒激光照射斑马鱼进行双光子荧光成像，呈现出清晰的红色荧光.与商业溶酶体绿色染料Lyso-Tracker Green共孵育显示红色荧光与绿色荧光具有良好的重叠，共定位系数（R）经计算为0.95.MTT实验结果表明，光敏剂IMBDP-Lys有极低的暗毒性（细胞存活率≥85%）和高的光毒性（IC50=0.52 μmol/L）.在660 nm近红外光照下，活性氧荧光探针DCFH-DA显示出绿色荧光，表明光敏剂在近红外光照下可以产生活性氧.此外，AO/EB细胞染色实验、细胞迁移实验结果表明，光敏剂IMBDP-Lys不仅可以诱导A549细胞凋亡，而且能够有效抑制肿瘤细胞的迁移.总之，双吲哚吗啉取代的近红外光敏剂IMBDP-Lys可以应用于双光子荧光成像和光动力治疗，是一种非常有应用前景的光敏剂.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220326.