苦参碱通过调控HMGB1/NLRP3信号途径抑制慢性鼻-鼻窦炎小鼠炎症反应

李特，宋天喜，秦喜昕，王建

（1.重庆北部宽仁医院耳鼻咽喉科，重庆 401120；2.九江市第三人民医院耳鼻咽喉科，江西 九江 332000；3.陆军军医大学第三附属医院耳鼻咽喉头颈外科，重庆 400042）

慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhinosinusitis,CRS）是一种慢性炎症性疾病，以慢性鼻塞、嗅觉减退和面部疼痛为特征[1]。CRS被认为是由遗传和环境因素共同驱动的复杂炎症过程的结果[2]。通常，CRS治疗策略主要通过减轻黏膜炎症、预防感染和清除鼻窦内黏液。CRS有多种治疗选择，包括生理盐水冲洗、局部鼻腔皮质类固醇喷雾、口服抗组胺药物和抗生素等[3]。即使在药物和手术治疗之后，CRS也会复发[4]。因此，迫切需要开发更有效、副作用最小、能够降低CRS复发率的治疗方法。研究显示，外界刺激通过NOD样受体家族包含pyrin结构域蛋白3（nod like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）和Caspase-1亚基诱导活性氧的产生激活NLRP3炎性小体，导致鼻上皮细胞IL-1β的成熟和分泌，从而加重鼻部炎症反应[5]。高迁移率族蛋白-1（high mobility group box protein-1,HMGB1）是一种炎症分子，可介导NLRP3炎性小体的激活以促进IL-1β的产生，从而加重炎症反应[6]。目前，CRS的发病机制尚不明确，而关于HMGB1/NLRP3信号途径在CRS中的作用也尚未可知，需进一步探究。苦参碱是一种小分子化合物（相对分子质量：248），属于羽扇豆碱，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗纤维化、抗过敏、抗伤害、保肝、护心和神经保护等多种药理作用[7]。已有证据显示，苦参碱可通过抑制HMGB1信号通路，抑制促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α和TGF-β1）的释放，从而发挥抗癌作用[8]。目前，关于苦参碱在CRS中的作用及其可能的作用机制尚不明确。因此，本研究通过建立CRS小鼠模型，旨在探究苦参碱是否通过调控HMGB1/NLRP3信号途径在CRS中发挥作用，以期为明确苦参碱对CRS的作用机制及开发新的CRS治疗策略提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠42只，购自陆军军医大学动物实验中心，生产许可证号：SCXK（渝）20170002，体质量（20±2）g，6～8周龄。小鼠饲养于室温（24±2）℃，相对湿度40%～60%，12 h/12 h明暗交替环境下，自由饮水及进食。待小鼠适应环境1周后，进行后续实验操作。

1.2 主要材料

苦参碱（质量分数≥98%）购自成都曼思特生物技术有限公司；重组HMGB1蛋白（rHMGB1）购自北京百普赛斯生物科技股份有限公司；天狼星红染色液和甲苯胺蓝溶液（1%水溶液）购自北京索莱宝科技有限公司；IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-αELISA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；MUC5B和MUC5AC抗体购自英国Abcam公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、HMGB1和GAPDH抗体购自北京义翘神州科技股份有限公司；NLRP3抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；ASC和Cleaved caspase-1抗体购自Cell Signaling Technology。

1.3 模型建立与分组给药

将42只小鼠随机分为对照组、模型组、苦参碱低、中、高剂量组、苦参碱高剂量+rHMGB1组，每组7只。参考文献[9]建立CRS小鼠模型。麻醉小鼠后，于小鼠鼻背正中处做一横行约3 mm切口，钝性分离皮下组织，暴露上颌窦腔，于上颌窦左右两侧开口处磨一个直径约为1 mm的小孔。将含1 μL肺炎链球菌菌液（6×108CFU/mL）的膨胀海绵（海绵体积为1 mm3）植入窦腔内。随后逐层缝合皮肤切口。对照组小鼠行相同手术操作但不植入含肺炎链球菌菌液的膨胀海绵。造模后第8周，参考文献[10]，记录造模组小鼠打喷嚏和挠鼻次数并按照表1所示进行评分，得分超过5分，则表示造模成功。随后，苦参碱低剂量组小鼠腹腔注射苦参碱7.5 mg/kg，苦参碱中剂量组小鼠腹腔注射苦参碱15 mg/kg，苦参碱高剂量组小鼠腹腔注射苦参碱30 mg/kg[11]，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠腹腔注射苦参碱30 mg/kg和20 μg rHMGB1[12]，对照组小鼠腹腔注射等量溶剂。每天给药1次，连续给药2周。

表1 小鼠打喷嚏和挠鼻评分标准Table 1 Scoring criteria of sneezing and nose scratching in mice

1.4 打喷嚏和挠鼻症状评分

末次给药24 h后，观察各组小鼠鼻部症状和一般情况。参考文献[10]和表1，对各组小鼠打喷嚏和挠鼻症状进行评分。

1.5 HE染色检测小鼠黏膜病理学变化

末次给药24 h后，小鼠经麻醉后处死。取小鼠鼻窦黏膜组织，4%（φ）多聚甲醛固定组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明。组织块石蜡包埋，切片机切片。石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素染色液染色15 min，切片流水冲洗1 min，1%盐酸乙醇分化3 s后，氨水返蓝，伊红染色液染色10 s后，流水冲洗。切片经脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。对各组小鼠上皮增生进行评分，上皮增生评分标准[13]：无增生计0分；轻微几乎检测不到计1分；轻微可检测计2分；中度计3分；重度计4分。应用CellSens Standard 1.7图像分析系统测定鼻组织中嗅觉和呼吸上皮过渡区的最大黏膜厚度。

1.6 天狼星红染色检测小鼠黏膜嗜酸性粒细胞的产生

鼻窦黏膜石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水清洗3次后，天狼星红染色液滴染1 h，流水冲洗后，无水乙醇快速冲洗切片，常规脱水透明，中性树胶封固。Image J软件对阳性细胞数进行计数。

1.7 甲苯胺蓝染色检测小鼠肥大细胞浸润

鼻窦黏膜石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水清洗3次后，添加甲苯胺蓝染液染色30 min。流水冲洗后，95%（φ）乙醇分色，常规脱水透明，中性树胶封固。Image J软件分析阳性面积。

1.8 ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量

末次给药24 h后，小鼠腹主动脉采血。将血液于室温条件下静置1 h后，3 000 r/min离心10 min收集上清液，即为血清。血清置于-80℃条件下保存。

1.9 Western blot检测小鼠MUC5B、MUC5AC、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达

取小鼠鼻窦黏膜组织，加入RIPA裂解液，冰上反应30 min后，离心收集上清液并通过BCA法测定其蛋白浓度。取30 μg蛋白上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳和转膜操作。5%脱脂奶粉室温条件下孵育3 h。向细胞中添加MUC5B（1∶1 000）、MUC5AC（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、HMGB1（1∶2 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Cleaved caspase-1（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗体稀释液，4℃条件下孵育过夜。添加特异性二抗（1∶5 000），室温条件下孵育1 h。滴加ECL发光液，凝胶成像系统检测蛋白条带，Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.10 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，实验数据以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦参碱对CRS小鼠临床症状的影响

造模前，各组小鼠精神状态良好，皮毛光滑，饮食规律。造模后，对照组小鼠无明显异常，其余组小鼠少量进食、饮水，可见流涕、频繁挠鼻、打喷嚏，鼻腔内有少量分泌物。经药物干预2周后，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量组+rHMGB1组小鼠上述症状有明显改善，而苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠较苦参碱高剂量组症状更为明显。与对照组相比，模型组小鼠症状评分明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠症状评分明显降低（P＜0.05），且苦参碱的作用呈剂量依赖性；与苦参碱高剂量组相比，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠症状评分明显升高（P＜0.05）。结果见图1。

图1 各组小鼠症状评分的比较Figure 1 Comparison of symptom scores of mice in each group

2.2 苦参碱对CRS小鼠鼻窦黏膜病理学变化的影响

对照组小鼠鼻窦黏膜上皮组织结构无明显异常，排列整齐，无明显炎性细胞浸润和腺体增生。与对照组相比，模型组小鼠鼻窦黏膜出现明显病变，黏膜上皮排列紊乱，有明显炎性细胞浸润，上皮增生评分、最大黏膜厚度、嗜酸性粒细胞数和甲苯胺蓝面积均明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠鼻窦黏膜病理学变化得到明显改善，上皮增生评分、最大黏膜厚度、嗜酸性粒细胞数和甲苯胺蓝面积均明显降低（P＜0.05），且苦参碱的作用呈剂量依赖性；与苦参碱高剂量组相比，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠鼻窦黏膜病变加深，上皮增生评分、最大黏膜厚度、嗜酸性粒细胞数和甲苯胺蓝面积均明显升高（P＜0.05）。结果见图2-5。

图2 HE染色检测各组小鼠黏膜病理学变化（200×）Figure 2 Mucosal pathological changes in mice of each group by HE staining（200×）

2.3 苦参碱对CRS小鼠炎症反应的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量明显降低（P＜0.05），且苦参碱的作用呈剂量依赖性；与苦参碱高剂量组相比，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量明显升高（P＜0.05）。结果见图6。

2.4 苦参碱对CRS小鼠杯状细胞黏蛋白分泌的影响

与对照组相比，模型组小鼠黏膜组织中MUC5B和MUC5AC蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠黏膜组织中MUC5B和MUC5AC蛋白表达明显降低（P＜0.05），且苦参碱的作用呈剂量依赖性；与苦参碱高剂量组相比，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠黏膜组织中MUC5B和MUC5AC蛋白表达明显升高（P＜0.05）。结果见图7-8。

图4 甲苯胺蓝染色检测各组小鼠肥大细胞浸润（200×）Figure 4 Mast cell infiltration of mice in each group detected by toluidine blue staining（200×）

图5 各组小鼠鼻窦黏膜病理学变化的比较Figure 5 Comparison of pathological changes of sinus mucosa in mice of each group

图7 Western blot检测各组小鼠MUC5B和MUC5AC蛋白表达Figure 7 Expressions of MUC5B and MUC5AC protein in mice of each group by Western blot

2.5 苦参碱对CRS小鼠EMT的影响

与对照组相比，模型组小鼠黏膜组织中E-cadherin蛋白表达明显降低（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠黏膜组织中E-cadherin蛋白表达明显升高（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显降低（P＜0.05），且苦参碱的作用呈剂量依赖性；与苦参碱高剂量组相比，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠黏膜组织中E-cadherin蛋白表达明显降低（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显升高（P＜0.05）。结果见图9-10。

图9 Western blot检测 各 组 小鼠E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达Figure 9 Expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin proteins in each group by Western blot

图8 各组小鼠MUC5B和MUC5AC蛋白表达的比较Figure 8 Comparisons of MUC5B and MUC5AC protein expressions in mice of each group(±s,n=7)

图10 各组小鼠E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的比较Figure 10 Comparison of E-cadherin，N-Cadherin and Vimentin proteins expressions in mice of each group

2.6 苦参碱对CRS小鼠HMGB1/NLRP3信号通路的影响

与对照组相比，模型组小鼠黏膜组织中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，苦参碱低、中、高剂量组和苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠黏膜组织中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达明显降低（P＜0.05），且苦参碱的作用呈剂量依赖性；与苦参碱高剂量组相比，苦参碱高剂量+rHMGB1组小鼠黏膜组织中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达明显升高（P＜0.05）。结果见图11-12。

图11 Western blot检测各组小鼠HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达Figure 11 Expressions of HMGB1，NLRP3，ASC and Cleaved caspase-1 proteins in each group by Western blot

图12 各组小鼠HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达的比较Figure 12 Comparison of HMGB1，NLRP3，ASC and Cleaved caspase-1 proteins expressions in mice of each group

3 讨论

CRS作为一种发病率高的疾病，除了给卫生保健系统带来巨大的经济负担外，还严重影响患者的生活质量[14]。因此，需开发新的、有效的疾病治疗策略以改善CRS疾病现状。本研究通过建立CRS小鼠模型，旨在探究苦参碱在小鼠CRS发生发展中的作用。本研究结果显示，苦参碱可通过抑制HMGB1/NLRP3信号途径，减轻CRS的EMT、炎症反应和黏液分泌，从而在CRS中发挥治疗作用。

CRS患者以一系列炎症介质（如前列腺素和白细胞介素）上调和炎性细胞浸润（如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞）为特征[15]。组织重塑是伤口修复的关键过程，但当调控不当时，可导致以气道上皮、固有层和黏膜下区域变化为特征的病理重建，从而导致各种慢性气道疾病（包括CRS）[16]。证据显示，上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）参与组织重塑过程，与CRS的发展有关[17]。因此，靶向抑制CRS的EMT和炎症反应可能是CRS的潜在治疗策略。苦参碱具有抗炎和抗EMT作用，可能成为治疗炎症和氧化应激相关疾病的潜在药物。例如，苦参碱通过抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路，减轻气道上皮细胞和哮喘小鼠炎症因子的产生、炎症细胞浸润、杯状细胞分化和黏液生成[18]。苦参碱还可上调上皮细胞特异性标志物E-cadherin表达，下调间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin表达，从而抑制胰腺癌细胞EMT[19]。此外，苦参碱对小鼠结肠炎中有明显的治疗作用。苦参碱通过减少出血和腹泻以及下调炎症因子（IL-1β和TNF-α）的表达来减轻结肠损伤和肠道炎症[20]。本研究结果显示，苦参碱低、中、高剂量组均可减少CRS小鼠临床症状，改善鼻窦黏膜病理学变化，抑制上皮增生、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润和降低黏膜厚度，抑制IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的产生，抑制黏蛋白MUC5B、MUC5AC和EMT相关蛋白N-cadherin和Vimentin的表达，促进E-cadherin表达，且苦参碱的作用呈剂量依赖性。该研究结果表明，苦参碱可抑制CRS小鼠炎症反应、黏液分泌和EMT，从而发挥治疗作用。

HMGB1是一种促炎介质，属于alarmin家族，在炎症和感染的刺激下，由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞释放到细胞间隙，也可以由死亡细胞释放[21]。HMGB1在不同的急性和慢性免疫疾病中发挥关键作用[22]。它不仅通过多种炎症因子和促炎细胞刺激免疫系统产生炎症反应，而且还参与NLRP3炎性小体的激活[23]。NLRP3炎性小体的异常激活与糖尿病、动脉粥样硬化、代谢综合征、心血管和神经退行性疾病等多种疾病有关，这引起了人们对探索NLRP3炎性小体潜在抑制剂的巨大兴趣[24]，例如，异丙酚预处理可使HMGB1依赖的NLRP3炎性小体信号失活，抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的产生，从而减轻LPS诱导的乳鼠心肌细胞炎症和凋亡[25]。已有证据显示，HMGB1参与CRS疾病进展，与疾病严重程度、嗜酸性粒细胞浸润、促炎细胞因子水平和EMT过程密切相关。靶向抑制HMGB1在治疗CRS疾病中具有潜在的应用价值[26]。目前，已有证据证明，苦参碱可通过抑制HMGB1通路信号转导和NLRP3炎性小体的激活，降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-1β炎症因子的产生，从而发挥疾病治疗作用[26-28]。本研究结果显示，CRS小鼠鼻窦黏膜中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达升高，而低、中、高剂量苦参碱处理CRS小鼠后，可降低HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达，且苦参碱的作用呈剂量依赖性。进一步实验结果显示，rHMGB1处理可部分逆转苦参碱对CRS小鼠的作用，导致HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表达明显升高，从而促进炎症反应、黏液分泌和EMT，加快小鼠CRS疾病进展。该研究结果表明，苦参碱通过介导HMGB1依赖的NLRP3炎性小体信号失活，在CRS小鼠中发挥治疗作用。

综上所述，本研究结果表明，苦参碱呈剂量依赖性抑制CRS小鼠炎症反应、黏液分泌和EMT，从而对CRS小鼠发挥保护作用。苦参碱在CRS小鼠中的作用机制可能与抑制HMGB1依赖的NLRP3炎性小体激活相关。该研究结果为阐明苦参碱在CRS小鼠中的作用机制及开发新的CRS治疗策略提供了新的实验依据。