蟾酥及其潜在代用品NJ2196抗LPS诱导小鼠神经炎症的等效性评价

钱意,张亚文,吕翔,朱雨雨,李念光,段金廒,周婧,马宏跃

(南京中医药大学药学院/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏 南京 210023)

蟾酥是我国传统名贵中药,由蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑框蟾蜍BufomelanostictusSchneider等耳后腺及皮肤腺分泌物经加工干燥而成,具有清热解毒、消肿止痛和开窍醒神的功效,是多种中药大品种和传统中成药的关键原料。随着蟾蜍生态环境的破坏和商业捕杀的增加,野生中华大蟾蜍数量急剧减少乃至面临濒危困境。虽然人工养殖近年快速兴起,但仍未解决资源紧张问题。蟾酥商品价格高昂、供需矛盾巨大迫使代用品研发十分必要[1]。

蟾酥含有复杂的化学物质,已知包括多样的蛋白质、多肽类大分子和强心甾、吲哚生物碱类小分子。从化学组学的视角审视,其活性物质尚未完全揭示。实验室前期采用Denovo转录组测序技术结合蛋白组学方法,率先报道了蟾酥中蛋白和多肽类物质,并对部分基因序列进行克隆验证[2-3];采用细胞亲和筛选的方法,报道了蟾酥中一些独特序列多肽[4];确定了一系列蟾酥内酯和生物碱的药效标志物[5-6]。基于实验室前期的工作,马宏跃、段金廒等设计了“化学特征类似、药效近同、安全性更高”的蟾酥潜在代用品,优化形成NJ2196。

本文是蟾酥和NJ2196等效性评价系统工作的一部分。鉴于免疫-神经系统互作在炎症反应方面的重要作用,本文选用了脂多糖(LPS)诱导小鼠神经炎症抑郁模型进行等效性评价。此外,本文首次报道蟾酥药材的抗炎性抑郁活性。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级ICR小鼠,雄性,体质量18～22 g,购自杭州医学院，实验动物许可证号：SCXK(浙)2019-0002,动物实验通过南京中医药大学伦理委员会审查,伦理号:202206A016。适应性饲养1周,饲养条件:温度22～26 ℃,昼夜节律,相对湿度40%～70%。

1.2 实验药物

蟾酥药材(产地:苏州),经马宏跃教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor的干燥分泌物,质量符合2020年版《中国药典》标准[7]。NJ2196由本实验室自制。盐酸氟西汀购自上海麦克林生化科技有限公司(货号:F844356)。

1.3 主要仪器

多功能酶标仪(瑞士Tecan公司);Nano-Drop超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司);qPCR仪(瑞士Roche公司);SCIEX QTRAP 5500液质联用仪(美国AB公司)。

1.4 主要试剂

LPS(兰杰柯科技有限公司,货号:BS904),白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(南京翼飞雪生物科技有限公司,货号:YFXEM00028,YFXEM00031),TRIzon Reagent(北京康为世纪生物科技有限公司,货号:CW0580),HiScriPt Ⅱ Q RT SuPerMix for qPCR(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:R223-01),Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司,货号:Q712-02),乙腈、异丙醇、甲醇和甲酸(美国Merck公司,色谱纯)，氘标记内标(IS)花生四烯酸(AA)-d8(美国Cayman Chemical公司,批号:20150513)。引物为上海生工生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 方法

2.1 实验分组及给药

将63只SPF级雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组、氟西汀组、蟾酥低剂量组、蟾酥高剂量组、NJ2196低剂量组、NJ2196高剂量组,每组9只。除对照组外,每组单次给予LPS(0.83 mg·kg-1,腹腔注射)。氟西汀组:予氟西汀30 mg·kg-1灌胃;蟾酥低剂量组:予蟾酥30 mg·kg-1灌胃;蟾酥高剂量组:予蟾酥90 mg·kg-1灌胃;NJ2196低剂量组:予NJ2196 30mg·kg-1灌胃;NJ2196高剂量组:予NJ2196 90 mg·kg-1灌胃,对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。小鼠行为学考察结束后,眼眶取血,用于血清IL-1β和TNF-α水平检测,随后断头取脑,分离出左脑海马体,用于qPCR检测,右脑用于脂质组学分析。

2.2 检测方法

2.2.1 悬尾实验 悬尾箱内部为黑色,长宽高均为25 cm,顶部中心用绳连接夹子,在小鼠尾端2 cm处固定,使小鼠呈倒悬状态,头部离悬尾箱底面约3.5 cm,观察6 min,统计后4 min的累计不动时间。

2.2.2 强迫游泳实验 把小鼠放入高20 cm,直径12 cm的圆形玻璃容器中,水温25 ℃,水深10 cm。每只小鼠观察6 min,统计后4 min的累计不动时间。

2.2.3 ELISA法检测血清中炎症因子水平 血液4 ℃自然凝固2 h,于4 ℃、4 000 r·min-1离心30 min,收集上清,按ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-1β和TNF-α水平。

2.2.4 qPCR法检测小鼠海马组织炎症因子和BDNF mRNA表达 采用Trizol法从小鼠海马组织中提取总RNA,Nano-Drop超微量紫外分光光度计测量RNA浓度。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix预混液制备样品及扩增。扩增条件为95 ℃预变性30 s,95 ℃变性10 s,退火/延伸60 ℃ 30 s,共40个循环。GAPDH作为内参, 2-△△Ct法计算mRNA相对表达水平。

2.2.5 高灵敏度脂质组学分析炎症相关介质 将小鼠右脑用乙酸乙酯和正己烷(v/v=1∶1,冷却至-20 ℃),以及25 μL AA-d8溶液(1 μg·mL-1)萃取。在冰水浴中超声,离心,收集上清液。样品浓缩并重新溶解在500 μL 90%乙腈中。使用HPLC系统在XBridge C18柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm,Waters)上进行色谱分析。流动相A是水、乙腈和甲酸(70∶30∶0.02,v/v/v)。流动相B是乙腈和异丙醇(50∶50,v/v)。流速为0.7 mL·min-1,样品分离如下:0～3 min,0～25%B;3～11 min,25%～45%B;11～13 min,45%～60%B;13～18 min,60%～75%B;18～18.5 min,75%～90%B;18.5～20 min,90%B;20～21 min,90%B～100%A;21～25 min,100%A。进样量为5 μL。采用QTRAP5500型质谱仪,阴离子、多反应检测(MRM)模式,主要仪器参数:气帘气压力10 psi,雾化气压力30 psi,辅助气压力30 psi,喷雾电压-4 500 V,离子化温度525 ℃。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 蟾酥和NJ2196对小鼠抑郁行为的影响

结果见图1,与对照组相比,模型组悬尾累积不动时间和强迫游泳累积不动时间显著增加(P<0.01),出现抑郁样行为;给予阳性药氟西汀,高、低剂量蟾酥和高、低剂量NJ2196后,小鼠悬尾累积不动时间和强迫游泳累积不动时间显著缩短(P<0.01),表现出抗抑郁作用;蟾酥与NJ2196各剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),表明两者在抗抑郁作用上有一定的等效性。

3.2 蟾酥和NJ2196对小鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影响

结果见图2,与对照组相比,模型组小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-1β水平均显著提高(P<0.01);与模型组比较,氟西汀组,蟾酥高、低剂量组,NJ2196高、低剂量组TNF-α和IL-1β水平均显著下降(P<0.01),表明蟾酥及其潜在代用品可降低血液炎症因子释放,具有抗外周炎症的作用;蟾酥与NJ2196各剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),表明两者在抗外周炎症因子作用上有一定的等效性。

3.3 蟾酥和NJ2196对小鼠海马组织炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响

结果见图3,与对照组相比,模型组小鼠海马组织炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.01);与模型组比较,氟西汀组,蟾酥高、低剂量组,NJ2196高、低剂量组小鼠海马组织炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA相对表达水平均显著下降(P<0.01),表明蟾酥及其潜在代用品可降低海马组织炎症因子释放,具有抗脑组织炎症的作用;蟾酥与NJ2196各剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),表明两者在抗脑组织炎症作用上有一定的等效性。

3.4 蟾酥和NJ2196对小鼠海马组织BDNF mRNA表达的影响

结果见图4,与模型组比较,蟾酥高、低剂量组,NJ2196高、低剂量组小鼠海马组织BDNF mRNA相对表达显著上升(P<0.01),表明蟾酥及其潜在代用品可提高BDNF mRNA表达水平;蟾酥与NJ2196各剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),表明两者在提高BDNF表达上有一定的等效性,如图4。

3.5 蟾酥和NJ2196对脑组织环氧合酶(COX)途径中炎症介质的影响

使用高灵敏度靶向脂质组学检测脑组织炎性脂质生物标记物的变化。在AA代谢的3个主要途径中,通过COX途径产生的代谢物发生了显著变化。模型组有10种来自COX途径的脂质上调。经蟾酥及NJ2196处理后,多数脂质显著减少(图5)。与对照组相比,模型组20-Ethyl PGE2、PGF2β、2,3-Dinor-PGE1显著增加(P<0.01)以及11-Deoxy-PGF1a/1b显著增加(P<0.05);与模型组相比,氟西汀组,蟾酥高、低剂量组,NJ2196高、低剂量组20-Ethyl PGE2、19(R)PGF1a、δ-12-PGJ2/PGJ2、PGF1a/1b、2,3-Dinor-PGE1均显著减少(P<0.01)。

4 讨论

本实验采用LPS刺激小鼠炎性抑郁模型,探究蟾酥及其潜在代用品的抗神经炎症活性。LPS会诱导啮齿动物的炎症刺激和行为改变,与人类抑郁症的临床症状相似[8]。临床研究已观察到IL-1β、IL-6和TNF-α水平与神经炎症之间存在正相关[9]。LPS导致促炎细胞因子增加,如TNF-α、IL-1β和IL-6等,会诱导小鼠的抑郁样行为产生[10-11]。BDNF在抗神经炎症方面有重要作用[12-14],且炎症标志物增加和BDNF信号传导中断有关[15]。

结果显示,给予LPS后小鼠悬尾累积不动时间和强迫游泳累积不动时间显著增加,说明LPS能诱导小鼠产生行为学异常。氟西汀、蟾酥和潜在代用品NJ2196能显著减少累积不动时间,改善抑郁样表型。在上述整体行为学指标上,不同剂量蟾酥和NJ2196组之间的活性强度近似,两者没有显著性差异,具有一定的等效性。

LPS刺激了小鼠外周循环系统促炎细胞因子TNF-α和IL-1β分泌显著增多;qPCR法检测小鼠海马组织中促炎因子相关基因表达水平发现,TNF-α和IL-6 mRNA的表达水平显著升高。炎症标志物增加和BDNF信号传导中断有关[12-14]。实验结果表明蟾酥和NJ2196在改善小鼠抑郁样表型、抑制小鼠外周血清促炎因子分泌、抑制小鼠海马组织中促炎因子表达和促神经保护因子表达方面具有显著的活性,而且两者间有一定的等效性。

为进一步研究蟾酥和NJ2196抗神经炎症的潜在机制,本实验进行了AA代谢脂质组学分析。脂质代谢在神经炎症反应中起着关键作用,当大脑受到炎性刺激,会释放游离AA,称为促炎介质的前体[16],在COX途径中,COX酶促进内源性氧化物PGH2的产生,然后转化为各种生物活性前列腺素(PG)。本实验中,LPS能诱导高水平COX产物,且在蟾酥和NJ2196组中,20-Ethyl PGE2、19(R)PGF1a、δ-12-PGJ2/PGJ2、PGF1a/1b、2,3-Dinor-PGE1等显著下调,这些脂质在炎症反应中发挥了极其复杂的生理作用。以上结果表明,蟾酥和NJ2196可能是通过COX途径对炎症因子进行调控。

综上所述,蟾酥及其潜在代用品NJ2196能够有效改善LPS诱导的小鼠神经炎症,对小鼠外周血清和中枢海马组织促炎因子水平有着显著抑制作用,且其潜在机制可能与COX途径代谢相关。本文在LPS刺激神经炎症动物模型上,评价发现蟾酥和NJ2196均具有抗炎性抑郁活性,而且两者有一定等效性,为后续在更大范围开展代用品药效学研究奠定了基础。