子宫内膜容受性检测在反复种植失败患者体外受精-胚胎移植中的应用

袁振亚，袁牧，林继慧，黄晓洁，朱云霞，宋雪梅

(徐州市妇幼保健院生殖医学中心，徐州 221009)

反复种植失败(RIF)是指在辅助生殖治疗周期中，接受多次优质胚胎移植均无法成功妊娠[1-2]。RIF在IVF-ET周期中的发生率高达10%～15%，其中约2/3的发生原因是子宫内膜不在容受期[3-6]。子宫内膜在特定时期才具有对胚胎的接受能力，称为种植窗(window of implantation，WOI)，处于WOI的内膜对胚胎具有最佳的容受性[7]。WOI出现的时间存在个体差异，按照统一的标准推算WOI，可能会有部分患者在子宫形态学和组织学完全正常的情况下，接受优质胚胎种植后无法成功妊娠。因此，选择合适的时机进行胚胎移植是治疗RIF、提高IVF-ET临床妊娠率的一种可行方法。

子宫内膜容受性检测(Endometrial receptivity testing，ERT)依托下一代测序(next-generation sequencing，NGS)技术，对子宫内膜容受性相关基因表达量进行分析，构建容受前期、容受期和容受后期预测模型。将受检者NGS结果代入模型，可以预测受检者当前子宫内膜是否处于容受期。根据ERT预测结果及时调整移植策略，在最佳容受期为受检者植入胚胎，可显著提高临床妊娠率[8-12]。多项ERT临床试验研究显示，接受ERT评估后移植的RIF患者冻融胚胎移植(FET)周期(无论是卵裂期胚胎或囊胚期胚胎)的种植率、临床妊娠率和持续妊娠率均显著高于未行ERT评估的普通FET周期[13-21]。为进一步评估ERT技术在中国RIF人群中的应用效果，我们对接受ERT评估后RIF患者的FET周期结局进行了回顾分析，探究ERT技术在本地区RIF患者IVF-ET周期中的应用价值。

资料和方法

一、研究对象

本研究选取2019年1月至2021年12月在徐州市妇幼保健院生殖医学中心接受FET的RIF患者和非RIF患者。接受ERT评估后移植的RIF患者纳入ERT组(n=60)，没有接受ERT评估的RIF患者纳入非ERT组(n=151)，同期非RIF患者纳入非RIF组(n=503)。

纳入标准：ERT组和非ERT组患者符合本中心RIF的诊断标准(移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4～6个或高评分囊胚数3个及以上均失败)；FET周期，采用激素替代周期进行内膜准备，移植1～2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚或1枚卵裂期胚胎+1枚囊胚序贯移植；移植胚胎均为优质胚胎(优质卵裂期胚胎：7CⅡ及以上，碎片率10%及以下；优质囊胚：内细胞团和滋养层评级均为B及以上)。

排除标准：FET前子宫内膜厚度小于7 mm；FET前患有复发性流产；接受胚胎植入前遗传学检测(pre-implantation genetic testing，PGT)周期的FET。

ERT技术的临床应用通过了徐州市妇幼保健院生殖医学伦理委员会的医疗技术临床应用伦理审查(审查意见号：XFYJL-2021-15)。

二、诊疗回顾

1.ERT评估模型：中南大学湘雅医院和江苏亿康基因科技有限公司合作开发了基于转录组测序的ERT技术(专利号：201910324707.0)，构建了子宫内膜容受前期、容受期、容受后期模型。采集受试者的子宫内膜样本，提取mRNA进行高通量测序，获得受试者的子宫内膜转录组信息代入模型进行分析，可以客观、精准地判断受试者的种植窗是否发生偏移，推算出受试者子宫内膜最佳容受期，准确率达98.4%，对RIF患者胚胎移植具有重要的临床指导意义[21]。本研究采用该模型，评估ERT在RIF患者FET中的应用效果。

2.激素替代方案准备内膜：月经第2天，ERT组、非ERT组、非RIF组患者使用长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，丽珠医药集团)，随后使用雌二醇4～6 mg/d连用14 d(雅培，荷兰)。非ERT组、非RIF组患者使用黄体酮(默克雪兰诺，英国)转化5 d(使用第1天定义为P+0)，第6天d(P+5)停用黄体酮，进行FET。ERT组患者第6天(P+5)停用黄体酮，接受内膜活检，根据ERT结果调整使用黄体酮的转化时长再行FET。

3.ERT评估：在ERT组患者黄体酮转化第6天(P+5)使用一次性子宫内膜样本采样器(苏州序康医疗科技)伸入宫腔抽吸约3 mm大小的活检样本，推入RNA样本保存液(苏州序康医疗科技)4℃保存；使用RNeasy Micro Kit试剂盒(Qiagen，德国)进行mRNA提取，使用MALBAC白金微量 RNA 扩增试剂盒(苏州亿康基因科技)进行RNA扩增，使用NGS 通用 Index 试剂盒(Illumina，美国)和Miseq基因测序仪(Illumina，美国)进行mRNA测序；将测序结果代入子宫内膜容受期模型，可判断患者当前的内膜状态(容受前期、容受期或容受后期)，以便调整移植时间，在容受期进行FET[21]。

4.FET：本研究选择3种胚胎移植策略：(1)1～2枚卵裂期优质胚胎；(2)1枚优质囊胚；(3)移植1枚卵裂期优质胚胎后2～3 d再移植1枚优质囊胚(序贯移植)。根据患者IVF周期的实际情况，选择合适的移植策略进行FET。

三、分析指标

各组患者基础资料，包括女方年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础激素水平；FET相关资料，包括移植日内膜厚度、移植胚胎数、胚胎种植率(孕囊数/移植胚胎数)、HCG阳性率(HCG阳性FET周期数/FET周期数)、生化妊娠率(生化妊娠FET周期数/FET周期数)、宫内妊娠率(宫内妊娠FET周期数/FET周期数)、异位妊娠率(异位妊娠FET周期数/FET周期数)、流产率(流产FET周期数/获宫内妊娠FET周期数)、活产率(活产分娩周期数/FET周期数)；ERT组患者种植窗偏移率(种植窗偏移患者数/接受ERT评估患者数)。

四、统计学处理

结 果

一、患者一般资料

本研究共纳入了符合标准的患者的714个FET周期。其中，接受ERT评估后移植的RIF患者(ERT组)60周期，未接受ERT评估的RIF患者(非ERT组)151周期，同期非RIF患者(非RIF组)503周期。

各组间女方年龄、不孕年限、BMI、抗苗勒管激素(AMH)水平及基础激素水平均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般资料(-±s)

二、ERT评估结果及相应移植时机调整

ERT组60个周期中有58个周期出现了种植窗的偏移，即在常规内膜准备情况下，按月经周期推算出的移植时期实际为容受前期，偏移率达到了96.67%(58/60)。容受前期属于子宫内膜的非容受期，在这个阶段对种植胚胎的容受性较差。根据ERT检测结果，这58个周期的移植时间较常规移植时间推后1～2 d，而2个种植窗未发生偏移的周期移植时间不变。

三、FET周期结局

各组间移植日内膜厚度、移植胚胎数、生化妊娠率、异位妊娠率均无显著差异(P>0.05)。ERT组胚胎种植率、HCG阳性率、宫内妊娠率、活产率均显著高于非ERT组(P<0.05)，与非RIF组相当(P>0.05)。ERT组流产率显著低于非ERT组(P<0.05)，且与非RIF组相当(P>0.05)。非ERT组HCG阳性率、宫内妊娠率低于非RIF组，但无显著差异(P>0.05)。非ERT组流产率显著高于非RIF组，而胚胎种植率、活产率显著低于非RIF组(P<0.05)(表2)。

表2 患者FET周期结局[(-±s)，%]

四、不同移植策略的FET周期结局

1.移植1～2枚优质卵裂期胚胎：ERT组、非ERT组与非RIF组分别有32周期、74周期、218周期移植1～2枚优质卵裂期胚胎。各组间移植日内膜厚度、移植胚胎数、HCG阳性率、异位妊娠率无显著差异(P>0.05)。ERT组种植率、宫内妊娠率、活产率显著高于非ERT组(P<0.05)，且与非RIF组相当(P>0.05)。ERT组流产率显著低于非ERT组与非RIF组(P<0.05)。ERT组生化妊娠率显著低于非ERT组(P<0.05)，且与非RIF组相当(P>0.05)。非ERT组胚胎种植率、宫内妊娠率、活产率显著低于非RIF组，而生化妊娠率、流产率显著高于非RIF组(P<0.05)(表3)。

2.移植1枚优质囊胚：ERT组、非ERT组与非RIF组分别有18周期、44周期、161周期移植了1枚优质囊胚。各组移植日内膜厚度、移植胚胎数、生化妊娠率、异位妊娠率、流产率均无显著差异(P>0.05)。ERT组种植率、HCG阳性率、宫内妊娠率均显著高于非ERT组与非RIF组(P<0.05)。ERT组活产率显著高于非ERT组(P<0.05)，与非RIF组相当(P>0.05)。非ERT组HCG阳性率、宫内妊娠率、活产率低于非RIF组，但无显著差异(P>0.05)。非ERT组胚胎种植率显著低于非RIF组(P<0.05)(表4)。

表3 移植卵裂期胚胎的FET结局比较[(-±s)，(%)]

表4 移植单个囊胚的FET结局比较[(-±s)，(%)]

续表

3.序贯移植1枚优质卵裂胚+1枚优质囊胚：ERT组、非ERT组、非RIF组分别有10周期、33周期、124周期移植了1枚优质卵裂期胚胎+1枚优质囊胚。各组间移植日内膜厚度、移植胚胎数、生化妊娠率、异位妊娠率均无显著差异(P>0.05)。ERT组HCG阳性率、宫内妊娠率显著高于非ERT组与非RIF组(P<0.05)。ERT组种植率高于非ERT组，但无显著差异(P>0.05)，且均显著低于非RIF组(P<0.05)。ERT组活产率显著高于非ERT组(P<0.05)，与非RIF组相当(P>0.05)。ERT组流产率显著低于非ERT组(P<0.05)，但均显著高于非RIF组(P<0.05)。非ERT组HCG阳性率、宫内妊娠率低于非RIF组，但均无显著差异(P>0.05)。非ERT组活产率显著低于非RIF组(P<0.05)(表5)。

五、ERT组宫内妊娠分析

ERT组有40个FET周期获得了宫内妊娠，其基础激素水平、女方年龄、移植胚胎数、BMI、不孕年限、移植日内膜厚度、移植1枚囊胚FET周期数占比、序贯移植FET周期数占比与20个未获宫内妊娠的FET周期均无显著差异(P>0.05)；未获宫内妊娠的ERT组患者移植卵裂期胚胎的FET周期数占比显著高于获得宫内妊娠的患者(P<0.05)(表6)。

表5 移植卵裂期胚胎+囊胚的FET结局比较[(-±s)，(%)]

表6 ERT组获宫内妊娠与未获宫内妊娠患者一般资料比较[(-±s)，n(%)]

讨 论

RIF是人类辅助生殖领域中亟待解决的重要问题，其发生原因繁杂且仍未完全被阐明，主要包括胚胎因素、免疫因素及宫腔因素等。多种免疫因子参与了胚胎种植和发育的过程，在RIF发生中发挥重要作用，但目前对于RIF患者是否应使用免疫治疗仍存在争议[22-23]。相比较于卵裂期胚胎，囊胚拥有更好的发育潜能和移植结局，可获得更高的临床妊娠率[24-25]。临床上，可采用PGT技术帮助筛选整倍体胚胎移植，降低因胚胎染色体异常导致种植失败、胚胎停育或自然流产的发生率，提高临床妊娠率[26]。

子宫内膜的容受状态对FET结局具有重要影响[21]。排除宫腔解剖学异常的因素，如果多次优质胚胎移植、甚至通过PGT技术获得整倍体胚胎移植后仍未获得成功妊娠，就需要考虑在胚胎移植时子宫内膜是否处于最佳容受期[27-28]。临床上通过改良促排卵方案、移植前宫腔搔刮、宫腔镜纠正内膜形态、移植前宫腔灌注HCG等可改善子宫内膜容受性，提高RIF患者胚胎种植率和临床妊娠率[29]。本研究结果证明，接受了ERT评估的RIF患者FET的胚胎种植率、宫内妊娠率与活产率均显著高于未接受ERT的RIF患者，且相当于非RIF患者，这与前期ERT研究[21，30]结果一致。

虽然结果显示ERT评估对RIF患者的FET结局具有显著改善作用，但本项研究存在局限性。接受ERT评估的RIF患者样本量较小，仍需更大样本量验证ERT评估对RIF患者FET结局的影响。此外，有一部分RIF患者经过ERT评估后仍未成功获得临床妊娠的情况值得关注。ERT是一种根据子宫内膜转录因子的变化特征判断胚胎最佳种植时期的技术，其本质上并不能改善患者的子宫内膜容受性，对于本身子宫内膜容受状态较差的患者作用不佳。本研究发现，相比获得宫内妊娠的ERT组RIF患者，未获宫内妊娠的ERT组RIF患者移植卵裂期胚胎的FET周期占比较高(65.00% vs. 47.50%，P<0.05)。比较ERT组三种移植策略的FET结局，仅移植卵裂期胚胎获得的宫内妊娠率(59.38%)低于移植单个囊胚(72.22%)和序贯移植(80.00%)的宫内妊娠率，提示经ERT评估的RIF患者采用单个囊胚移植和序贯移植的策略可能获得更佳的FET结局，但仍需要更多临床研究和基础实验进一步探讨。

RIF在IVF治疗中的发生率可达10%～15%，其复杂的病因决定了治疗方法的多样化，需要针对不同病患人群选择合适的治疗方案，这正是目前辅助生殖领域面临的挑战。本研究中患者平均年龄较小(≤33岁)，通过ERT评估后移植获得了较好的FET结局，但ERT对高龄RIF患者的效果仍需进一步探究。相比低龄人群，高龄RIF患者面临的主要问题可能是卵巢储备差、卵巢功能低反应、胚胎质量差、胚胎非整倍体率高等客观不利因素，经IVF周期获得的可用胚胎更少。多个移植周期均失败，给RIF患者带来了经济和身体上的双重打击。在子宫内膜最佳容受期完成胚胎移植，对于避免浪费珍贵胚胎、保存患者生育力至关重要。因此，对于RIF患者，应以ERT技术为保障，精准定位最佳容受期，同时根据实际情况可结合PGT技术筛选整倍体胚胎，以期获得最佳FET结局。ERT技术可为RIF患者制定移植策略提供指导和依据，在RIF患者的IVF-ET周期中有广泛的应用前景和重要的临床应用价值。