巴泰病毒诱导小鼠神经母细胞瘤细胞凋亡

唐 甜,李丽霞，梁晓彤，员晓庆，黄良宗，廖洁丹，赵秀宇，金宁一，刘 昊,*

(1.佛山科学技术学院，广东 佛山 528000；2.黑龙江北大荒农垦集团创业农场有限公司，黑龙江 佳木斯 156321；3.军事科学院 军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林 长春 132122)

巴泰病毒 (Batai virus，BATV) 是布尼亚病毒目(Bunyavirales)泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus) 布尼亚姆韦拉 (Bunyamwera) 血清组的成员[1-2]。迄今为止，它是布尼亚姆韦拉组中唯一从亚洲分离到的病毒，其分布范围很广泛，遍及欧洲和亚洲，以及非洲部分地区[3]。BATV可对人致病且多表现为非特异性发热症状，有的重症患者发展为脑膜炎，畜禽可出现神经症状和繁殖障碍疾病，可引起牛的神经症状和鸭的产蛋量下降等，而且在我国南方地区发热病人血清中也检测到该病毒抗体[4]。值得注意的是，BATV可以与其他正布尼亚病毒属成员发生基因重配，产生致病力更强的病原体。据报道，BATV曾与Bunyamwera病毒发生基因重配形成新毒株Ngari病毒，该病毒在东非曾引起数十余万人感染,近千人死亡，给人类健康造成严重威胁，因此引起国际社会的广泛关注[5]。

BATV可引起多种细胞发生病变，可使小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)出现萎缩和变圆的现象。而细胞凋亡 (apoptosis) 是一种机体面对外界刺激的主动应答由基因编码的贯穿整个生命活动的一种细胞程序性死亡过程，细胞凋亡可自然发生或由外界因素如病毒感染诱导发生，受感染宿主细胞的凋亡被认为是抑制病毒传播的一种强有力的机制，也被认为是感染病毒后造成宿主细胞损伤的一种机制，已有研究证明一些病毒的复制与宿主细胞的凋亡密切相关[6-8]。例如，冠状病毒科的猪流行性腹泻病毒已证实可诱导 Vero E6 细胞凋亡，水貂阿留申病毒诱导感染后猫肾细胞(CrFK)后出现了明显的典型凋亡特征，同为泛布尼亚病毒科的汉坦病毒可诱导HEK-293细胞凋亡，其中介导细胞凋亡的核心蛋白酶Caspase-3的活性均较于对照组增加[9-11]。但是，目前对BATV的研究主要集中于流行病学调查和诊断方法建立等，至今对其感染神经细胞的致病机制仍完全未知。因此，开展BATV诱导细胞凋亡研究将有助于揭示病毒致病机制具有重要的科学指导意义。该研究为认识BATV的发病机制及抗病毒治疗提供新思路和依据。

1 材料与方法

1.1 病毒株及细胞BATV(NM/12)株及小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞保存于本课题组。

1.2 主要试剂Cell Counting Kit-8 (CCK-8)购自南京诺维赞生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、免疫染色通透液 (Triton X-100)、QuickBlock免疫染色封闭液、Caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；Caspase-3引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 细胞培养N2a细胞放入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.4 病毒培养及TCID50测定待96孔板N2a细胞贴壁数量达70%～80%时，用2%胎牛血清的DMEM细胞维持液10倍梯度稀释BATV原液，每个梯度设置8个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养，用Reed-Muench法计算病毒株TCID50。

1.5 BATV感染N2a细胞活性测定将对数生长期的细胞接种于96孔板中，放入37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，利用CCK-8试剂盒对细胞活性进行检测。

1.6 感染BATV的N2a细胞IFA检测用100TCID50的BATV感染N2a细胞后，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20 min后弃去，加入PBST洗涤3次，每次5 min。免疫染色通透液(Triton X-100)室温通透20 min后，PBST洗涤3次。封闭液封闭1 h后，加入BATV单克隆抗体，37℃ 孵育1 h。PBST洗3遍。加入的二抗为FITC兔抗鼠IgG，室温避光孵育2 h。PBST洗涤，DAPI核染5 min。同上方式洗涤后荧光显微镜下观察。

1.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡BATV感染N2a细胞后分别收集感染 24，48，72 h后的细胞，用预冷PBS离心洗涤细胞，1×binding buffer重悬细胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，轻柔混匀后室温避光孵育5 min后上机检测。

1.8 Caspase-3活性检测按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书检测其活性变化，分别在BATV感染N2a细胞24，48，72 h后收集细胞，离心经PBS洗涤后冰浴裂解15 min，4℃、16 000×g离心15 min 后收集上清，配制反应体系后加入10 μL caspase-3底物(Ac-DEVD-pNA)，37℃孵育2 h，酶联免疫检测仪测定在405 nm波长吸光度，求3个复孔平均值。

1.9 数据分析采用GraphPad Prism 7.0软件制图,并采用SPSS 17.0处理数据,进行统计学分析,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 WST-8法检测BATV感染N2a细胞的存活率选择对数生长期的N2a细胞，将0.5，1.0,2.0 MOI 的BATV接种细胞，培养48 h后加入CCK溶液，按CCK8试剂盒照说明书计算细胞存活率。结果显示，N2a细胞对BATV比较敏感，用0.5 MOI的BATV感染N2a细胞48 h可抑制N2a细胞生长，并且随着病毒滴度增加，抑制细胞生长的程度越大(图1 A)。当以2 MOI BATV感染N2a细胞时，12 h即可检测到显著抑制N2a细胞的生长，并且随着病毒感染时间的增加，抑制细胞生长的程度也随之增大(图1B)。

2.2 IFA检测N2a细胞中BATV抗原IFA特异性检测结果显示，通过荧光显微镜观察BATV感染24 h的N2a细胞，可见细胞出现大量绿色荧光，且主要集中于细胞膜，即为感染了巴泰病毒的阳性细胞(图2)。

A.感染BATV N2a细胞(×100)；B.未感染病毒细胞(×100)

2.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测N2a细胞凋亡利用1.0 MOI和0.5 MOI BATV感染N2a细胞24，48，72 h后观察细胞凋亡情况。结果显示,BATV可诱导N2a细胞发生早期和晚期凋亡 (图3 A～F)。用1.0 MOI BATV感染细胞24，48，72 h后，早期细胞凋亡率分别为3.28%，7.66%和27.42%，晚期凋亡率分别为4.35%，12.63%和26.27%，具有显著性差异 (P<0.05)(图3 A，C，E),用0.5 MOI BATV感染细胞24，48，72 h后，早期细胞凋亡率分别为2.46%，6.84%和13.91%，晚期凋亡率分别为9.33%，10.39%和25.97%，具有显著性差异 (P<0.05)(图3 B,D,F)；并且，用1.0 MOI 和0.5 MOI BATV感染细胞24，48，72 h后，早期细胞凋亡和晚期凋亡均随着时间的延长而增加 (图4)。

A.1 MOI感染细胞24 h；B.0.5 MOI感染细胞24 h；C.1 MOI感染细胞48 h；D.0.5 MOI感染细胞48 h；E.1 MOI感染细胞72 h；F.0.5 MOI感染细胞72 h

A.BATV诱导细胞早期凋亡百分比；B.BATV诱导细胞晚期凋亡百分比

2.4 BATV感染N2a细胞后Caspase-3活性检测Caspase-3活性检测试验结果显示，BATV感染N2a细胞24 h时Caspase-3活性未被激活，随着感染时间的增加，Caspase-3活性升高，并且在48 h 升高最为明显 (P<0.001)，但在72 h细胞Caspase-3活性检测值低于空白对照组(图 5)。

图5 感染 BATV对N2a细胞Caspase-3活性的影响

3 讨论

目前，细胞凋亡已成为宿主受到外界刺激后研究的热点问题，研究病毒对细胞凋亡的影响，有助于深入了解病毒的致病机理，对于抗病毒治疗和探索细胞内分子有重要意义。据报道，泛布尼亚病毒科、汉坦病毒属的汉坦病毒的增殖可诱导人胚肾细胞 (HEK-293) 凋亡，相关检测Bcl-2蛋白表达量降低,Bax蛋白表达量升高,Cyt-c蛋白及Caspase-3酶原活化片段表达量升高[11]。研究发现，多种虫媒病毒可诱导细胞凋亡，如白蛉热病毒属的庞塔托鲁白蛉热病毒(Punta Toro virus，PTV)可导致HepG2细胞被阻滞在G0/G1期，Caspase-3/7被显著激活，磷脂酰丝氨酸易位和DNA断裂也在48,72 h时被检测到，表明其可诱导细胞凋亡[12]。正布尼亚病毒属的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)激活Caspase-8 和Caspase-9能分别通过外源和内源途径诱导Vero细胞凋亡[13]。内罗病毒属的哈扎拉病毒(Hazara virus ，HAZV)感染细胞后可导致细胞凋亡，其进一步的特征是DNA阶梯和Ccaspase-3/7活性升高[14]。BATV可感染Vero、BHK-21和N2a等多种细胞，引起明显的细胞病变，以及小鼠神经症状等，但关于细胞凋亡的研究仍处于空白。因此，以上虫媒病毒引起细胞凋亡的研究为BATV诱导N2a细胞的凋亡提供了坚实的理论基础。

本试验结果表明，BATV感染N2a细胞后24 h出现明显CPE现象，利用WST-8法检测BATV感染N2a细胞的存活率与感染剂量和时间呈负相关，证明BATV对N2a细胞的生长具有抑制作用。IFA检测到BATV可在N2a细胞中增殖，因此可进一步利用Annexin V-FITC/PI双染法检测BATV在不同浓度和时间诱导细胞凋亡情况。流式细胞仪分析显示，感染细胞在24，48，72 h发生早期凋亡和晚期凋亡并随着时间的延长而增加，确定BATV可诱导N2a细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶家族所产生的级联反应是细胞凋亡的中心环节，而Caspase-3是Caspase家族中的最重要和关键的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，Caspase-3的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志，激活的Caspase-3能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活,从而使细胞凋亡[15-16]。在感染初期即24 h时，与对照组相比，Caspase-3活性无明显变化，但在72 h时间点Caspase-3活性降低，说明随感染时间的延长，Caspase-3活性反而减弱，这是因为Caspase-3主要在病毒感染的早期发挥促凋亡作用，感染晚期出现细胞坏死等其他死亡形式，细胞凋亡不再起主导作用，所以BATV感染N2a细胞后期Caspase-3活性出现减弱趋势[17]；而感染48 h时，Caspase-3活性值显著增强，表明Caspase-3途径在病毒诱导的细胞凋亡过程中被激活，最终进一步证实BATV可诱导N2a细胞凋亡。综上所述，本试验通过不同方法证明BATV可感染N2a细胞并引起凋亡，该结论为进一步研究BATV诱导细胞凋亡的分子机制及途径和其致病机理提供了重要理论依据。