不同胃肠消化阶段紫花芸豆蛋白的抗氧化活性和结构特征

贾 斌，毛小雨，许馨予，杨鹄隽，张慧敏，3，左 锋，2*

（1 黑龙江八一农垦大学食品学院 黑龙江大庆 163319 2 黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心 黑龙江大庆 163319 3 粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心 黑龙江大庆 163319）

机体受生活环境、年龄等多因素的影响，体内自由基的产生与消除平衡逐渐被打破，多余的自由基会对生物大分子造成一定的损伤[1-2]。流行病学研究发现，食物源抗氧化剂对人体健康有积极的作用，比如紫花芸豆在体内消化后的蛋白质水解物可以改善或减少氧化还原状态标记，经常食用芸豆可缓解一些慢性疾病发生，如心脑血管疾病、Ⅱ型糖尿病和肥胖等[3]。来源丰富的植物蛋白原料经人体消化后，产生的肽段的抗氧化活性较高，其中较短的肽具有较强的自由基猝灭作用，易于人体吸收[4-5]。

人体摄入食物后，经过胃肠消化这一复杂过程中消化环境的变化以及组分间的相互作用，对食物中营养物质的消化吸收产生影响[6]。齐宝坤等[7]采用胃部模拟消化方式对大豆分离蛋白（SPI）进行处理，通过中红外光谱发现经胃蛋白酶的消化后，SPI 的二级结构发生显著改变。石嘉怿等[8]以大米谷蛋白为原料，通过体外模拟肠部消化，比较不同消化时间下胰蛋白酶对大米谷蛋白内源荧光和二级结构的影响，结果发现胰蛋白酶作用于β-折叠使谷蛋白结构展开，内源荧光强度增加，蛋白质生物活性明显增强。Sarker 等[9]以红芸豆为原料，通过酶解发现水解液的抗氧化活性高于抗坏血酸（AA），能较好地抑制酸奶中氧化物质生成，与对照组相比，可延缓酸奶中45.8%的氧化物质生成。Shan 等[10]报道豆科植物蛋白具有多样性，在人体内豆类蛋白水解物不仅以氨基酸的方式吸收，还以多肽的形式消化吸收，根据其结构性质、氨基酸组成和序列排序变化对蛋白水解物的抗氧化活性产生影响。有关芸豆蛋白及水解物具有较高的抗氧化活性已有大量报道，然而，经人体消化后，特别是胃肠不同消化时期，其蛋白水解物的抗氧化活性、氨基酸组成及结构变化鲜有报道。

本文采用体外模拟胃肠道消化模型，研究胃肠不同消化阶段芸豆蛋白的抗氧化活性、氨基酸含量、巯基含量、二级结构及微观结构，解析芸豆蛋白水解物的抗氧化及结构特征，为紫花芸豆蛋白（KPI）的精深加工及开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫花芸豆，黑龙江省林甸县。

胃蛋白酶、胰蛋白酶，赛国生物科技公司；DPPH、VC 标准品、ABTS，阿拉丁试剂公司；（TAOC）检测试剂盒，北京索莱宝公司；氯化钾、铁氰化钾、溴化钾等其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

冷冻干燥机，德国CHRISTA 公司；U-2019 型紫外-可见分光光度计，日本HITACHI 公司；DYCZ-24K 型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；TENSOR27 傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker公司。

1.3 试验方法

1.3.1 紫花芸豆蛋白（KPI）的制备 参照马文鹏等[11]的方法略作修改。芸豆浸泡、去皮、烘干、粉碎过60 目筛后，石油醚脱脂烘干。芸豆粉按1∶12 与水混合，pH 值调至9 后搅拌90 min，离心收集上清液，对沉淀2 次提取。收集2 次上清液pH 值调至4.5，离心后将沉淀去离子水水洗3 次，将pH值调至中性，离心后冻干得KPI。

1.3.2 体外模拟胃肠连续消化 将紫花芸豆蛋白（KPI） 分散在去离子水中配置成50 mg/mL 溶液，以中性磷酸盐缓冲液作溶剂，将KPI 缓冲液与人工模拟胃液缓冲液[12]（6.9 mmol/L KCI 溶液，0.9 mmol/L KH2PO4溶液，25 mmol/L NaHCO3溶液，47.2 mmol/L NaCl 溶液，0.1 mmol/L MgCl2（H2O）6溶液，0.15 mmol/L CaCl2（H2O）2溶液） 等体积混合，pH 值调至3.0 后添加胃蛋白酶，37 ℃恒温反应结束后加入等体积人工模拟小肠缓冲液（6.8 mmol/L KCI 溶液，0.8 mmol/L KH2PO4溶液，85 mmol/L NaHCO3溶液，38.4 mmol/L NaCl 溶液，0.33 mmol/L MgCl2（H2O）6溶液，0.6 mmol/L CaCl2（H2O）2溶液），pH 值调至7.0 后加入胰蛋白酶，消化期间维持温度37 ℃、pH 值7.0 稳定。对不同时间（0.5，2，3 h）上清液进行取样，灭酶、冷却和低温高速离心后收集上清液冷冻干燥，部分沉淀用于电泳。

1.3.3 紫花芸豆蛋白及消化产物水解度及溶解度测定 采用邻苯二甲醛（OPA）法对KPI 消化过程的水解度[13]进行测定。将0.1 mol/L 的中性磷酸缓冲液与不同消化阶段样品配制成5 mg/mL 溶液（下同），与OPA 试剂（1∶20）混合后，避光3 min，340 nm 处测吸光度值。水解度（DH）按式（1）计算。

式中：h——样品水解肽键数；htot取决于原料总肽键数（芸豆htot=7.72）。

溶解度测定参考Mirmoghtadaie 等[14]报道的方法。

1.3.4 紫花芸豆蛋白及消化产物抗氧化活性

1.3.4.1 总抗氧化能力测定 总抗氧化能力 （TAOC）测定试验使用试剂盒，试验方法见说明书。

1.3.4.2 还原能力测定 将不同消化阶段的KPI在超纯水中配制成5 mg/mL 的溶液。取2 mL 配制好的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液和2 mL 1%铁氰化钾与2 mL 蛋白样液40 ℃下混匀，再加2 mL 三氯乙酸溶液（10%）离心，将上清液2 mL 与超纯水（2 mL）、氯化铁溶液（1%，0.6 mL）混匀，待测液颜色由黄转蓝时700 nm 处测吸光度。以超纯水做空白对照[15]。

1.3.4.3 DPPH 自由基清除能力测定 取KPI 消化液0.5 mL 避光条件下与3.5 mL DPPH （1×10-4mol/L，95%乙醇）混匀，静置30 min，734 nm 处测吸光度A1，超纯水替换KPI 消化液作对照组A2，乙醇替换DPPH 作空白组A3[16]。

DPPH 按公式（2）计算：

1.3.4.4 ABTS 测定 参照Pihlanto 等[17]的方法和步骤测定ABTS。0.1 mL KPI（5 mg/mL）与3.9 mL ABTS 工作液混匀，在734 nm 处，6 min 内完成吸光度A1测定，95%乙醇代替KPI 溶液测空白值A0。

ABTS 采用公式（3）计算：

1.3.5 超滤分级及分级产物抗氧化活性测定 对胃肠连续消化样品超滤分级，选用不同分子质量大小超滤膜（100，50，30，10 ku）分段分级。

根据前期测定的抗氧化活性结果，选用胃肠连续消化0.5，2，3 h 的冻干样品，适度稀释后进行超滤分级，分析不同分子质量100～50 ku，50～30 ku，30～10 ku，＜10 ku 的紫花芸豆蛋白模拟消化产物对抗氧化活性（测定方法同1.3.4.1、1.3.4.2、1.3.4.3、1.3.4.4 节）的作用效果。

1.3.6 SDS-PAGE 参照Yadav 等[18]的方法并适当调整。分别取1.3.2 节中的KPI 溶液和酶解液1 mL，加入1 mL 0.125 mol/L Tris-HCl 缓冲液，水浴煮沸3 min，离心后收集上清液用于电泳。电泳条件：浓缩胶5%，分离胶质14%，上样量10 μL，恒压模式下进行。

1.3.7 傅里叶变换中红外（MIR-FTIR）光谱测定取200 mg 烘干后的KBr 与2 mg 冻干粉混匀研磨成细粉，压片机制透明薄片，设置参数为扫描次数32 次，间隔0.1 s，在400～4 000 cm-1范围内进行扫描。

1.3.8 紫花芸豆蛋白及消化产物巯基含量测定 采用Ellman 法测定KPI 及消化产物的巯基含量。参照Tang 等[19]的方法稍加调整。取配制好的1 mL 样品液（5 mg/mL）分别加入到5 mL 无添加和添加尿素（8 mol/L）的Tris-Gly 缓冲液中，对暴露巯基和总巯基含量进行测定。在缓冲液中加入40 μL Ellman's 试剂 （5 mg/mL），412 nm 处测吸光度。

1.3.9 紫花芸豆蛋白及消化产物氨基酸含量测定 参照韩晶[20]的测定方法进行前处理，将处理好的滤液利用氨基酸自动分析仪进行测定。

1.4 扫描电镜（SEM）

将KPI 及消化后的冻干样品真空下电镀喷金，适当调整位置和放大倍数后扫描观察。

1.5 数据统计

2 结果与分析

2.1 体外模拟消化期间消化产物溶解度、水解度分析

紫花芸豆蛋白模拟消化在不同时期的溶解度、水解度变化如图1所示。由图1a 可知，天然芸豆蛋白溶解度为（58.47±0.33）%。经胃部胃蛋白酶处理的蛋白样液溶解度为（68.72±1.02）%，与天然紫花芸豆蛋白相比提升了17.53%，这是因为芸豆蛋白分子结构致密，分子中亚基依靠二硫键、疏水相互作用相交联[21]，在胃蛋白酶水解作用下，使芸豆蛋白中巯基断裂，分子质量变小，肽链变得疏松，亲水基团更多被暴露，不溶性基团含量降低，促使胃部水解产物具有更好的溶解性；进一步经历肠部消化阶段后，芸豆蛋白水解物的溶解度为（66.34±1.12）%，与胃部消化相比溶解度下降了3.46%，这是因为随水解程度进一步加深，暴露出大量的疏水性和巯基基团，在疏水性基团与二硫键作用下，小分子肽链相互交联形成了大分子难溶性成分[22]。由图1b 可知，芸豆蛋白初始水解度几乎为零，芸豆蛋白经过胃部消化后水解度为（9.67±0.72）%，经肠道胰蛋白酶水解后，因胃蛋白酶与胰蛋白酶对肽链作用位点不同，在两种酶协同作用下，其水解度达到（21.30±1.05）%，与胃部消化相比胃肠水解度增加了120.27%。李鹏飞[23]研究表明，在酶解作用下随着植物蛋白DH 增加，酶解产物平均分子质量通常也会降低，并且低分子质量水解产物具有更好的抗氧化性能。

图1 不同消化时期溶解度（a）及水解度（b）变化Fig.1 The change of solubility （a） and degree of hydrolysis （b） in different digestion periods

2.2 芸豆蛋白及消化产物SDS-PAGE 电泳分析

芸豆蛋白及模拟胃肠消化产物电泳图谱如图2所示。芸豆蛋白分子质量分布在66 ku 以下，其中45 ku 亚基条带主要是球蛋白[24]，31～20 ku 处存在的几条亚基条带，可能为芸豆蛋白中的小分子球蛋白和植物凝集素[25]。从图2可以看出：芸豆蛋白经过胃部模拟消化后，因酶解作用45 ku 亚基条带明显减小，但仍然存在未被酶解的球蛋白，这可能是部分球蛋白在胃部酸性条件下，以二聚体或三聚体形式稳定存在，胃蛋白酶较难将其完全水解所致[26]；在31～20 ku 处存在的几条亚基条带经胃蛋白酶水解成＜20 ku 小分子肽段，但蛋白水解不完全仍有条带残留。在经历肠道消化后，在胃蛋白酶与胰蛋白酶协同作用下45 ku 球蛋白亚基条带继续减小，并且胃部未完全消化的31～20 ku的亚基条带会继续发生水解作用，使＜14.4 ku 亚基条带明显加深。由此可知，肠部消化产物平均分子质量与胃部相比明显降低。

图2 紫花芸豆蛋白及模拟胃肠消化产物SDS-PAGE 图谱Fig.2 SDS-PAGE profile of purple kidney bean protein and simulated gastrointestinal digestion products

2.3 芸豆分离蛋白及消化产物抗氧化活性分析

不同酶作用的肽链位点不同，随着水解度与溶解度升高，肽链被酶切割变短，小分子肽段增加，水解液的抗氧化性能增强[27]。芸豆蛋白模拟消化在不同时期抗氧化活性变化如表1所示。

从表1可知，芸豆蛋白总抗氧化为（0.66±0.12）mg prot/mL，经胃部及胃肠消化后，总抗氧化能力呈现不断上升趋势。胃部消化过程中，总抗氧化能力达到（2.45±0.36）mg prot/mL，与芸豆蛋白相比提升了271.21%，经过肠部消化结束后，总抗氧化能力达到（3.07±0.41）mg prot/mL，与胃部消化相比总抗氧化能力进一步提升了25.31%。芸豆蛋白消化产物铁还原能力、ABTS 清除率在经历胃肠不同消化时期也呈现了上升趋势。这表明芸豆蛋白经历胃肠消化后，胃蛋白酶和胰蛋白酶对芸豆蛋白水解的位点不同，共同作用下水解芸豆蛋白使蛋白水解生成更多的小分子多肽并暴露了具有特异性酶切位点[28]，使消化产物中的小分子多肽与ABTS+、铁离子更好的发生结合反应，提升了消化产物的铁还原能力、ABTS+清除率。

表1 芸豆蛋白及消化产物抗氧化测定Table 1 Antioxidant determination of kidney bean protein and digested products

与胃部消化后的蛋白水解物相比，进一步肠部消化后芸豆蛋白水解物的DPPH 清除能力略有降低，并且差异性显著。这是胃部消化水解后，一些肽被分解成小片段暴露出部分疏水性氨基酸残基，DPPH 自由基被稳定，而经过肠部消化后疏水性氨基酸减少，亲水性氨基酸增多，难以与脂溶性DPPH 自由基结合[29]，这与表3疏水性氨基酸变化一致。

2.4 不同分子质量的芸豆蛋白模拟胃肠道消化产物的抗氧化能力分析

为深入研究经胃肠模拟消化后抗氧化能力的分布情况，通过超滤分级四种不同分子质量紫花芸豆蛋白消化的抗氧化能力如图3所示。从图3a可知，消化0.5 h 时，分子质量在100～50 ku 总抗氧化活性低于＜10 ku 的多肽，随消化时间延长，两者差距减小，但分子质量＜10 ku 消化产物仍表现出最强总抗氧化能力，即小分子肽段显示出较强抗氧化性。郭晓娟[30]对羽扇豆蛋白进行超滤分析研究酶水解产物的总抗氧化能力时也发现，在＞10 ku、3～8 ku 和＜3 ku 3 个组分中，发现＜3 ku 分子质量的胰酶水解产物表现出最强的总抗氧化能力。从图3b～3d 可知，随着分子质量的减小以及消化时间的延长，铁还原能力、DPPH 清除能力、ABTS清除能力也持续增加。但是在0.5 h 时，不同分子质量铁还原能力、DPPH 清除能力变化平缓，陈树俊等[31]对核桃粉酶解、超滤后也发现，≤5 ku 的多肽的铁还原能力、DPPH 清除能力均高于另外3 种多肽（5～10、10～30 和≥30 ku），说明此时芸豆蛋白水解不完全，Fe3+、脂溶性DPPH 与消化产物的螯合能力较弱。

图3 不同分子质量紫花芸豆蛋白模拟胃肠道消化产物的抗氧化能力Fig.3 Different molecular weight purple kidney bean protein simulates the antioxidant capacity of gastrointestinal digestive products

2.5 芸豆蛋白及胃肠消化产物MIR-FTIR 分析

经红外测定去卷积化处理后得芸豆蛋白及消化产物二级结构定量信息见表2。

由表2知，KPI 二级结构中含量最高的是β-折叠，Byanju 等[32]分析4 种豆类蛋白的二级结构变化也发现α-螺旋不作为芸豆蛋白的主要结构，而β-结构是芸豆蛋白的主要二级结构。经模拟胃肠道连续消化后，KPI 消化产物二级结构中α-螺旋、β-转角含量先增加后减少，β-折叠先减少后增加，无规则卷曲含量减少。其中，随着KPI 在胃部消化期间酶解程度不断加深，与芸豆蛋白相比，β-折叠变化显著，由41.14%减少到34.63%，β-转角含量大幅增加，表明胃蛋白酶的水解使蛋白质结构被展开，空间结构上较为紧凑的β-折叠被破坏，转变为较松散的β-转角维持稳定蛋白质的三级结构[33]。在肠部消化期间，随消化时间延长且消化环境由强酸性转变为中性，芸豆蛋白稳定结构重新恢复，β-折叠由34.63%增加到41.29%。曾琪等[34]研究pH 值处理对黑豆分离蛋白结构时也同样发现，pH 值由强酸性逐渐提升至近中性时，蛋白质中β-折叠含量显著上升，这与本文研究结果一致。

表2 酰胺I 带拟合芸豆蛋白及消化产物二级结构组成Table 2 Amide I band fitting kidney bean protein and digestion product secondary structure composition

2.6 体外模拟消化期间芸豆蛋白消化产物巯基含量变化分析

由图4可知，与紫花芸豆蛋白相比，消化后的暴露巯基、总巯基含量不断下降。经胃部消化后的暴露巯基、总巯基含量为 （5.85±0.29）μmol/g、（7.11±0.37）μmol/g，与芸豆蛋白相比下降40.12%，36.69%，这是由于在胃部消化期间，蛋白分子水解后相互聚集，部分巯基形成二硫键，形成较为稳定的结构，导致暴露巯基、总巯基含量下降；进一步经过肠道消化后，消化产物的暴露巯基、总巯基降至（4.94±0.23）μmol/g、（6.14±0.20）μmol/g，这可能是在胰蛋白酶作用下，蛋白分子进一步舒展，巯基基团间空间阻碍被解除，游离巯基之间易形成二硫键，进而导致巯基含量降低。也有研究表明，半胱氨酸（Cys）含有活性巯基，经过胃肠连续消化后半胱氨酸（Cys）含量降低也会导致巯基含量下降[35]，这与表3半胱氨酸含量变化相同。

图4 紫花芸豆蛋白及模拟消化期间消化产物的巯基含量变化Fig.4 Changes in sulfhydryl content of purple kidney bean protein and digested products during simulated digestion

2.7 模拟消化期间芸豆蛋白胃肠消化产物游离氨基酸含量变化分析

芸豆蛋白水解后，氨基酸从母体蛋白中释放出来，Chen 等[36]发现His、Tyr、Cys 等许多氨基酸及其衍生物具有将电子转移到自由基的能力，对蛋白水解液的抗氧化性有一定的提升作用。KPI及消化产物游离氨基酸含量变化如表3所示。

由表3可知，经胃部消化后，与芸豆蛋白相比，酶解作用水解出更多的游离氨基酸，必需氨基酸总量占总氨基酸含量的比例由14.903%增加到37.853%，而含硫氨基酸总量由2.73 μg/g 减少为2.67 μg/g，这与巯基含量变化趋势（图4）保持一致。疏水性氨基酸含量增幅明显，由10.98 μg/g 增加到21.59 μg/g，这些氨基酸能够使短肽与脂溶性自由基相互作用，进而提高消化产物的抗氧化能力。与胃部消化相比，经胰蛋白酶消化后，肠部消化产物含硫氨基酸总量由2.67 μg/g 减少为2.08 μg/g，必需氨基酸占比增多，这与肽键持续裂解导致较短肽（三肽和二肽）和游离氨基酸大量积累有关[37]。同时，胃部、肠部模拟消化的疏水性氨基酸含量变化与脂溶性DPPH 自由基清除变化趋势相同（表1），表现为先增加后减少。

表3 芸豆蛋白及消化产物游离氨基酸含量变化Table 3 Kidney bean protein and digestive products free amino acid content

2.8 扫描电镜（SEM）图像分析

紫花芸豆蛋白及模拟消化产物的扫描电镜图如图5所示。由图5可以清晰直观的观察样品的微观外形构造特点，芸豆蛋白电镜图（图5a）表面呈现密实光滑立体结构。经过胃部模拟消化后，芸豆蛋白在酸性条件下变得松散无序，且在表面形成细密小孔，随着水解进行呈现絮状聚集现象（图5b）。经肠道模拟消化后，与胃部消化相比，因在中性条件下蛋白微观结构有序性有所增加，消化产物表面呈现细密颗粒状（图5c）。由此可知，经过胃部、肠道消化后，蛋白表面微观结构逐步发生明显变化，表面变得无序、松散、粗糙多孔，并且蛋白结构变化及小分子肽段产生从而改变了消化产物的抗氧化活性。

图5 芸豆蛋白（a）、模拟胃部消化2 h（b）及模拟肠部消化3 h（c）SEM 图Fig.5 Kidney bean protein，simulated stomach digestion 2 h and simulated intestinal digestion 3 h SEM absorption spectrum

3 结论

紫花芸豆蛋白在体外模拟消化过程中，芸豆蛋白消化产物的溶解度、水解度显著升高，肠道消化结束后溶解度、水解度分别达到（66.34±1.12）%、（21.30±1.05）%，与胃部消化相比水解度增加了120.27%，溶解度下降了3.46%。经SDSPAGE 图谱及抗氧化活性分析发现，芸豆蛋白在肠道环境中持续水解导致消化产物平均分子质量明显降低，＜14.4 ku 亚基条带明显加深，与胃部模拟消化相比水解产物抗氧化能力显著增强，总抗氧化能力、铁还原能力、ABTS 清除率分别提升25.31%，85.76%，53.80%，而DPPH 清除能力下降了3.02%。对芸豆蛋白酶解、超滤分级后发现，分子质量＜10 ku 的多肽总抗氧化能力、铁还原能力、DPPH 和ABTS 自由基清除能力显著高于其它3种多肽（100～50 ku、50～30 ku、30～10 ku）。经MIRFTIR 分析发现，α-螺旋、β-转角含量先增加后减少，β-折叠先减少后增加，无规则卷曲含量减少。胃肠消化产物中暴露巯基、总巯基含量、含硫氨基酸总量随水解程度增加持续下降，与胃部消化相比，肠部消化产物的暴露巯基、总巯基含量、含硫氨基酸总量分别下降了15.56%，13.64%，22.13%。SEM 扫描分析发现，经过体外模拟消化后，蛋白表面微观结构逐步发生明显变化，表面变得无序、松散、粗糙多孔，与胃部消化相比经肠道模拟消化后，蛋白微观结构有序性有所增加，消化产物表面呈现细密颗粒状。