中华蚊母树在干旱-水淹交叉胁迫下形态和活性氧代谢的适应机制

李晓玲，杨 进，孙 雷,，黄应平，朱士江，吕 坤,，胥 焘,，黄桂云，张国禹

1 三峡库区生态环境教育部工程研究中心，湖北省三峡地区生态保护与治理国际联合研究中心, 宜昌 443002 2 三峡大学生物与制药学院，宜昌 443002 3 中国长江三峡集团有限公司长江珍稀植物研究所，宜昌 443000

随着全球气候变暖,植物应对干旱和水淹胁迫的生理生态适应机制引起了生态学者的广泛关注[1—2]。由于三峡大坝的修建,形成了水位落差将近30m、面积达349km2的季节性涨落的消落带[3]。同时,三峡库区夏季暴雨洪水和高温干旱频发,促使水位变化频率加快,导致部分消落带在短期内形成水淹和干旱交叉胁迫现象[4]。这种大幅度、高频次的水位涨落将严重影响三峡库区的安全、健康和可持续发展[5]。因此,深入研究植物对干旱-水淹交叉胁迫下的特异性生理生态适应机制,对高效保护库区的生态环境、充分利用土著生物改善消落带生态具有重要意义。

中华蚊母树(Distyliumchinense)是金缕梅科(Hamamelidaceae)蚊母树属(Distylium)多年生常绿河岸带小灌木[22],是三峡库区河岸带的优势树种和表征种[23],具有耐淹性好、适应性强等特点,其根系发达、生长快,分布广泛,是三峡库区消落带理想的防沙固土树种。同时,也是一种较好的园林绿化植物[24]。目前研究主要集中在半淹或全淹等单一因子对中华蚊母树形态、光合作用等方面的变化[25—26],而关于干旱-水淹交叉胁迫下,中华蚊母树形态及ROS代谢的生理适应机制尚未见报道。本文通过研究干旱-水淹交叉胁迫及恢复生长阶段施加不同外源物质(Glu、ABA、Pro),对中华蚊母树幼苗的形态及ROS清除的状况,拟解决以下3个问题：(1)作为三峡库区河岸带优势树种的中华蚊母树,在遭受干旱-水淹交叉胁迫时,其在形态学方面产生哪些适应性机制？(2)在遭受干旱-水淹交叉胁迫后,如果中华蚊母树能够存活和恢复生长,那么中华蚊母树的ROS清除系统会产生哪些变化？(3)胁迫恢复阶段,施加外源物质,是否对中华蚊母树的恢复生长产生影响？通过对上述问题的回答以阐明中华蚊母树对干旱-水淹交叉胁迫的形态和ROS代谢的适应机制,可为进一步研究如何提高其在消落带生境存活率提供基础科学数据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

2017年9月中下旬采集野外种群随机成熟的种子,共计2000粒,种植在15cm×13cm的塑料盆中让其自然萌发生长,种植基质选用腐殖质土和壤土(按1∶4的比例混合均匀,土壤pH为6.25,土壤含水量为27.32%,土壤容重为1.38g/cm3),盆内土层厚度约为12cm,所有幼苗具有相同的生长环境,且给予除草等常规管理。生长一年后,用于室外模拟实验,实验设置在三峡大学生态实验基地(111°32′E,30°73′N,海拔高度134m,年平均降雨量992.1—1404.1mm)进行。

1.2 实验设计

于2018年12月从移栽苗中挑选长势和大小相近的450盆进行实验处理。将实验用苗随机分为5组,每组90盆,每组再随机分为30盆,共3个重复,每个重复30盆。其中,10盆用于形态学调查,20盆用于生理生化指标的测定。共设置4个阶段,阶段1为干旱阶段,包括对照组(常规供水,CK)、4组干旱(简称D)处理,共计5个处理组,每个处理组3个重复,每个重复30盆,每个处理组为90盆。对照组CK即为正常供水组,土壤含水量保持在田间持水量的80%(土壤含水量采用称重法确定)。干旱时间设置4周；阶段2为干旱恢复阶段,将阶段1的CK组继续常规供水,D处理组于干旱阶段结束当天施加3种不同外源物质(4mg/L ABA[27]、30mg/L Pro[28]、360mg/L Glu[29]),叶面均匀喷施ABA(简称A)和Pro(简称P)、根部浇灌Glu(简称G)以及胁迫后不施加外源物质(简称N),见图1。此时,干旱恢复处理(简称R)组包括常规供水(CK)、施加脱落酸(该处理简称D-R-A)、施加脯氨酸(该处理简称D-R-P)、施加葡萄糖(该处理简称D-R-G)及胁迫恢复不施加外源物质(该处理简称D-R-N)5个不同处理组。干旱恢复生长设置3周；干旱恢复阶段结束后,立即将幼苗浸水进行水淹(F)阶段。阶段3为水淹阶段,将阶段2的CK处理组常规供水(CK),其他4个处理组进行水淹处理,共5个处理组,水淹时间设置9周；阶段4为水淹恢复阶段,将阶段3的处理组(不包括CK)施加3种外源物质,此时,水淹恢复处理组包括常规供水(CK)、施加脱落酸(该处理简称D-R-A-F-R-A)、施加脯氨酸(该处理简称D-R-P-F-R-P)、施加葡萄糖(D-R-G-F-R-G)及不施加外源物质(该处理简称D-R-N-F-R-N)5个不同处理组,水淹恢复生长设置3周。

干旱及水淹处理植株放于80cm×50cm×40cm的塑料篮内,每个塑料篮放15盆,共计24个塑料篮,3种外源物质4个处理(不包括CK),每个处理3次重复,每个重复30盆,共360株,干旱、水淹及正常处理放置于13个水池(2m×1.5m×2.5m)中进行(干旱6个水池、水淹6个水池、正常处理1个水池)；对照处理进行常规供水,定期更换水池中的水,实验示意图见图1。盆内土层厚度约为12cm,所有植株置于三峡大学生态实验基地生长。干旱从2018年10月25日开始,干旱采取自然连续干旱模式,每5天采用称重法测一次土壤含水量,直至土壤含水量达到30%停止干旱,11月22日停止干旱复水恢复至12月13日,继续进行水淹处理至2019年2月14日停止水淹恢复至3月7日。采取裂区设计的方法,水池随机放置植株和塑料篮,每两周随机轮换一次位置,以此减少位置效应的影响。同时,由于模拟用水相对清澈,为充分模拟库区消落带水体浑浊带来的低光强环境,在水池上方布设一层遮阳网,使到达水下植物的光照强度小于10μmol m-2s-1[30]。所有植株实验期间均不施肥。

图1 实验设计图Fig.1 Experimental design drawingA：脱落酸 Abscisic acid；P：脯氨酸 Proline；G：葡萄糖 Glucose；C：对照 Control；N：进行胁迫处理但恢复阶段不施加外源物质 Stress treatment was carried out but no allogenic materials were applied in the recovery stage

在干旱及水淹处理的最后一天,与干旱及水淹恢复处理的最后一天,于每个重复内随机采集长势良好的叶片10片,洗净,并用定性滤纸擦干后迅速放入液氮,速冻5min,放置于超低温冰箱(-78℃)保存,用于生理生化指标的测定。

1.3 形态特征的测定

每个处理期最后一天,测定用于形态学调查的10株植物的株高、基径、不定根数、叶片数及嫩枝数。

1.4 生理指标的测定

参照Giannopolitis等[31]的方法检测SOD活性。50μL酶液加入0.3mL 13mmol/L Met、0.3mL 1.3μmol/L核黄素、0.3mL 63μmol/L NBT、1.5mL 50 mmol/L PBS(pH 10.2)、0.3mL 0.1mmol/L EDTA、0.25mL蒸馏水。于4000 lx日光下反应20min,测定560nm处吸光值。

参照Wang等[32]的方法检测CAT活性。0.5mL酶液中加入2mL 50mmol/L PBS (pH7.0)、0.5mL 40mmol/L H2O2,于240nm下测定H2O2的分解率。

参照Kanamoto[33]的方法检测APX活性。0.1mL酶液中加入0.1mL 0.1mmol/L EDTA、0.1mL 0.5mmol/L ASA、1.6mL 50mmol/L PBS(pH 7.0),加入0.1mL 0.1mmol/L H2O2启动反应,测定290nm处吸光值。

参照Bates等[35]的方法测定Pro含量。称取0.5g叶片,加入10mL 3%磺基水杨酸沸水提取10min,3000r/min离心10min。取2mL清液,加入2mL冰醋酸、2mL 2.5%酸性茚三酮,沸水浴100min,加入甲苯萃取色素,于520nm测定甲苯相吸光度。采用脯氨酸标准品绘制标准曲线,计算Pro含量。·OH采用ELISA试剂盒(南京建成)测定。

1.5 数据分析

采用R语言对数据进行图表绘制和统计分析。水淹、干旱胁迫对幼苗的影响,采用aov()函数进行单因素方差分析；利用corrgram包中的corrgram()函数作出相关系数矩阵图,以检验施加不同外源物质对ROS清除的影响,采用multcomp包中的glht()函数进行单因素方差分析,并进行多重比较；为了比较ROS清除系统的相对重要性,采用psych包的principal()函数进行PCA分析,以对ROS清除系统进行检验。采用Excel 2010和SPSS 19.0数据分析软件对形态指标的差异性采用单因素方差分析(One-way ANOVA,Duncan′s multiple range test多重比较)。

2 结果与分析

2.1 干旱-水淹交叉胁迫对中华蚊母树形态学特征的影响

经过干旱4周恢复至正常生长,后再水淹胁迫9周对中华蚊母树幼苗形态学特征产生了显著影响(P<0.05)。中华蚊母树幼苗经过4周干旱胁迫后,株高、基茎、不定根数、叶片数及嫩枝数与对照没有显著差异,但经过后期水淹胁迫9周后,较对照组株高显著降低,生长减缓,基茎显著增加,不定根也显著增加,叶片脱落,嫩枝略有增加但不显著(表1)。结果表明干旱-水淹交叉胁迫过程中幼苗形态特征的变化,有利于幼苗适应后期水淹胁迫的低氧条件,表明前期干旱胁迫促进了对后期水淹胁迫的耐受性。

表1 干旱和水淹交叉胁迫对中华蚊母树形态学特征的影响(均值±标准误)

2.2 干旱-水淹交叉胁迫对中华蚊母树ROS代谢的影响

图2 干旱和水淹交叉胁迫对中华蚊母树幼苗ROS含量及ROS清除的影响Fig.2 Effects of alternate drought and flooding stresses on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedlingsROS: 活性氧 Reactive oxygen species;不同处理间标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)

2.3 胁迫恢复期施加不同外源物质对ROS清除的协同作用

图3 恢复期施加不同外源物质,中华蚊母树酶促系统、非酶促系统、ROS的相关系数矩阵图Fig.3 The matrix diagram of correlation coefficient of enzymatic system, non-enzymatic system and ROS of D. chinensewith different exogenous substances during the recovery growth 超氧阴离子自由基 Superoxide anion free radical；·OH：羟自由基 Hydroxyl radical; SOD：超氧化物歧化酶 Superoxide dismutas;；APX：抗坏血酸过氧化物酶 Ascorbate peroxidase；CAT:过氧化氢酶 Catalase; Pro：脯氨酸 Proline

2.4 恢复期施加不同外源物质对中华蚊母树幼苗的影响

干旱与水淹恢复阶段施加ABA、Pro、Glu等外源物质,中华蚊母树幼苗ROS含量及ROS清除系统产生了差异(图4和图5)。外源添加Pro,SOD、CAT、APX活性升高,·OH与含量降低；外源添加Glu,SOD、CAT、APX活性未升高,但·OH与含量降低；外源添加ABA,内源Pro含量升高。说明外源添加Pro,可能是通过增强SOD、CAT、APX等保护酶的活性,进而清除ROS；外源添加Glu,保护酶未增强,但植株具有清除ROS的其他途径；外源添加ABA,可诱导植株内源Pro的生成,进而可清除·OH。同时,外源施加ABA,与内源Pro含量表现出强的正相关性。

图4 干旱胁迫恢复阶段施加不同的外源物质(ABA、Glu、Pro)对中华蚊母树幼苗ROS含量及ROS清除的影响Fig.4 Effects of different exogenous substances (ABA, Glu, Pro) on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedlings during the recovery growth of drought stressD-R-A：干旱-恢复施加脱落酸 Drought-recovery with abscisic acid (ABA)； D-R-N：干旱-恢复不施加任何物质Drought-recovery with no any matter；D-R-G：干旱-恢复施加葡萄糖 Drought-recovery with glucose(Glu)；CK：对照 Control； D-R-P：干旱-恢复施加脯氨酸 Drought-recovery with proline (Pro)

图5 干旱-水淹恢复阶段施加不同的外源物质(ABA、Glu、Pro)对中华蚊母树幼苗ROS含量及ROS清除的影响Fig.5 Effects of different exogenous substances (ABA, Glu, Pro) on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedling during the recovery growth of drought-flooding stressesD-R-A-F-R-A：干旱-恢复施加脱落酸-水淹-恢复施加脱落酸 Drought-recovery with abscisic acid (ABA)-flooding-recovery with ABA； D-R-N-F-R-N：干旱-恢复不施加任何物质-水淹-恢复不施加任何物质 Drought-recovery with no any matter-flooding-recovery with with no any matter; D-R-G-F-R-G: 干旱-恢复施加葡萄糖-水淹-恢复施加葡萄糖Drought-recovery with glucose(Glu)-flooding-recovery with Glu；CK: 对照 Control; D-R-P-F-R-P：干旱-恢复施加脯氨酸-水淹-恢复施加脯氨酸 Drought-recovery with proline (Pro)-flooding-recovery with Pro

3 讨论

3.1 干旱-水淹交叉胁迫对中华蚊母树形态学特征的影响

水淹胁迫后,水分过多会引起土壤通气性差和植株根际周围缺氧[19]。这种不良的根际环境会影响根系对水分和矿物质的吸收和转运,从而引起植株生长减慢和叶片衰老脱落。胁迫后,植株的生长状况可作为判断植株幼苗水淹耐受能力的重要指标之一[36- 37]。经过4周干旱胁迫恢复后再水淹胁迫9周对中华蚊母树的生长影响显著(表1)。中华蚊母树在形态学上对水分胁迫表现出了适应性。面临水淹胁迫,植物可能具有两种策略：耐受性与逃避策略[38]。中华蚊母树幼苗在遭受水淹胁迫时,叶片的减少可能有利于植株的存活,植株通过脱落叶片的耐受性策略来应对厌氧代谢等造成的巨大消耗,以此保证根部的存活。同时中华蚊母树植株为适应这种水淹缺氧状态,在水淹初期开始形成少量不定根、茎基部开始膨大,随着水淹时间的延长形成更多的不定根,茎基部膨大部分形成大量皮孔,茎增粗[25]。水淹过程中不定根和肥大皮孔的产生,这是耐淹木本植物对水淹的标志性形态反应之一[39]。有研究表明这些肥大的皮孔有大量的细胞间隙增强了气体扩散,给被水淹的根系提供氧气,是茎和不定根在大气和内部组织间进行气体交换的一种重要途径,以便于植物在水淹胁迫下度过不良的外界环境[19,25,39]。同时,在水淹胁迫过程中不定根的形成通过给植株提供水分、矿物质和激素来维持其生长,使植株耐受水淹[40]。就不定根的发生和茎基部膨大的皮孔来讲,中华蚊母树在形态上表现出对水淹有一定的适应能力。由此可见,前期干旱胁迫促进了中华蚊母树对后期水淹胁迫的适应,如通过叶片脱落、形成不定根及茎基部膨大等形态学的变化增强植物对水淹胁迫的适应。

3.2 酶促系统对中华蚊母树清除非生物胁迫冗余ROS的影响

图6 非生物胁迫下,中华蚊母树ROS可能的产生途径及外源物质对清除ROS的促进作用Fig.6 Under abiotic stress, the possible ROS production pathways and the promoting effect of allogenic material on scavenging ROS in the D. chinensePPP：磷酸戊糖途径 Pentose phosphate pathway；NADPH：还原型辅酶II,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原态)Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(reduced state)；NADP+：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化态) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(oxidation state)； NOX：NADPH氧化酶 NADPH oxidase；ASA-GSH：抗坏血酸-谷胱甘肽 Ascorbic-glutathione

3.3 非酶促系统对中华蚊母树清除非生物胁迫冗余ROS的影响

图7 干旱与水淹阶段酶促系统及非酶促系统在清除ROS中的贡献率Fig.7 Contribution rate of enzymatic and non-enzymatic system on ROS scavenging during drought and flooding stresses

3.4 外源物质的添加对中华蚊母树冗余ROS清除的影响

逆境胁迫解除后的快速生长恢复能力是判断消落带岸生物种幼苗水淹耐受能力的重要指标之一[30]。Stewart等采用ABA处理干旱胁迫小麦叶片,Pro大量积累,表明外源添加ABA,可诱导植株内源Pro的积累,进而清除·OH[15]。外源施加ABA后,中华蚊母树的Pro显著增加(图4和图5),有利于·OH的清除。施加Pro后,中华蚊母树幼苗CAT、APX酶活性显著增强(图4和图5),表明外源施加Pro,中华蚊母树可能通过增强CAT与APX等抗氧化酶系统的活性,进而清除环境压力产生的冗余ROS。在应对应激胁迫时,植物体内的可溶性糖含量将大量增加[51],Glu可通过氧化的PPP(磷酸戊糖途径)提高NADPH的产生,而NADPH是ASA-GSH循环的重要辅助因子[17],同时Glu的添加与·OH表现出显著的负相关(图4)。但外源施加Glu,保护酶活性未显著升高(图4)。因此,我们推断外源添加Glu,可能是通过增强中华蚊母树的ASA-GSH循环,从而以ASA为底物的APX将H2O2降解为H2O,同时,可间接降低·OH的含量(图6)。因此,ABA、Pro、Glu等外源物质的施加,可促进中华蚊母树对逆境胁迫产生的冗余ROS的有效清除。

3.5 干旱-水淹交叉胁迫对中华蚊母树逆境胁迫耐受能力的影响