HPLC法同时测定藏龙蒿中6种有机酸类成分的含量

于庚原，贾姗姗，张童画，徐浩然，杜小伟，瓮学智，孙毅坤*

1. 北京中医药大学中药学院，北京 102488；2. 北京市药品检验研究所，北京 102206；3. 北京市丰台区食品药品安全监测中心，北京 100071

藏龙蒿(Artemisiawaltonii)为菊科蒿属植物，藏语中称为“普尔芒那保”，其地上部分可治疗虫病、炭疽、疫疽、皮肤病[1]，是常用的藏药之一。藏龙蒿与同属其他植物(如茵陈、艾叶等)，在外观上极为相似，难以鉴别，易被混淆[2-3]。目前，藏龙蒿的相关研究较少，其质量标准仍处于空白阶段，亟待补充与完善。本课题组在前期的研究中发现，藏龙蒿中含有多种以咖啡酰奎宁酸为结构母核的有机酸类成分，主要包括新绿原酸(5-咖啡酰奎宁酸)、绿原酸(3-咖啡酰奎宁酸)、隐绿原酸(4-咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸A(3,5-二咖啡酰奎宁酸)、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C(4,5-二咖啡酰奎宁酸)等，且在同属其他植物中(如茵陈、艾叶等)其含量存在一定差异。研究发现，该类有机酸成分具有抗菌[4-6]、抗氧化[7-8]、抗炎[9-10]、抗病毒[11]、免疫调节[7]、保肝[12-13]、抗肿瘤[14-15]、抗紫外线及抗辐射等多种药理作用[16]。因此，本研究选取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C作为含量测定指标，用高效液相色谱法同时测定上述6种有机酸类成分，以期建立快速、准确和稳定可靠的含量测定方法，为藏龙蒿质量标准的制定提供借鉴和参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 1525型高效液相色谱仪(Waters 2707自动进样器、Waters 2489紫外检测器、Empower 3工作站，美国Waters公司)；CPA225D型十万分之一天平、SQP型千分之一天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 试药

对照品：绿原酸(批号110753-200413，质量分数96.2%，中国食品药品检定研究院)，异绿原酸A(批号Z05M10X87215，质量分数为98%)，异绿原酸C(批号Y03S10H95976，质量分数为98%)，隐绿原酸(批号P16A10U95423，质量分数为98%)，新绿原酸(批号P30N10L104575，质量分数为98%)，1,5-二咖啡酰奎宁酸(批号P26F9F54633，质量分数为98%)，均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；磷酸(分析纯，北京化工厂)；水为超纯水。藏龙蒿(河北安国药材市场，批号：2019092102、2019092301、2019092703)由北京市药品检验研究院常增荣主任药师鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

XBridge®C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司)；流动相为乙腈(A)-0.5 mL·L-1磷酸水(B)，洗脱方式为梯度洗脱：0～5 min，5% A；5～10 min，5%～10% A；10～15 min，10%～12% A；15～27 min，12%～16% A；27～45 min，16%～28% A；45～63 min，28% A；63～75 min，28%～40% A。流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为327 nm；进样量为5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 分别精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.07、4.46、0.06、5.40、1.50、0.90 mg·mL-1的对照品储备液，4 ℃保存备用。分别精密吸取对照品储备液1 mL，置于5 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取藏龙蒿药材粗粉约1 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入体积分数为50%的甲醇20 mL，称定质量。水浴加热回流提取90 min，取出放冷，称定质量，用体积分数为50%的甲醇补足质量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。色谱图见图1。

注：A.混合对照品溶液；B.藏龙蒿供试品溶液；1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.异绿原酸A；5.1,5-二咖啡酰奎宁酸；6.异绿原酸C。

2.3 方法学考察

2.3.1线性关系考察 分别精密吸取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C对照品储备液适量，稀释得到不同质量浓度的对照品溶液。按照本实验的色谱条件分别进样，记录色谱峰的峰面积，以对照品的质量浓度(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标，绘制散点图并进行线性回归，得到新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的标准曲线及线性回归方程，结果见表1。

表1 6种化学成分的回归方程及线性范围

2.3.2精密度实验 取2.2.1项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，分别记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的峰面积，计算各成分的RSD值，结果分别为1.06%、0.99%、1.10%、0.96%、0.93%、0.94%，表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性实验 取同一批次的藏龙蒿药材6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样，分别记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的峰面积，计算各成分的RSD值，结果分别为0.89%、1.51%、1.75%、1.76%、1.65%、0.77%，表明本实验方法重复性良好。

2.3.4稳定性实验 取2.2.2项下供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、8、12、24 h后，按2.1项下色谱条件进样，记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的峰面积，计算各成分的RSD值，结果分别为1.52%、1.34%、1.40%、1.40%、1.48%、1.29%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5加样回收率实验 精密称取6种对照品适量，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为0.129 5、10.285 7、0.236 6、10.504 0、2.568 8、1.671 4 mg·mL-1的对照品溶液，备用。取已知各成分含量的藏龙蒿药材粗粉约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入上述对照品溶液各1 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样分析，记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的峰面积，计算各成分的加样回收率，6种成分的平均加样回收率(n=6)分别为107.07%、93.95%、102.34%、99.54%、105.48%、101.71%，表明本实验方法准确性良好，见表2。

表2 6种化学成分的加样回收率实验结果 (n=6)

表2(续) 6种化学成分的加样回收率实验结果 (n=6)

2.4 样品含量测定

取不同批次的藏龙蒿药材，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样，分别测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C的峰面积，按照线性方程计算各成分的含量，结果见表3。6种成分的平均含量分别为0.03%、2.01%、0.05%、2.04%、0.47%、0.31%。

表3 6种成分的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

本研究考察了超声法和加热回流法提取方法，实验结果表明加热回流法效果较好，故用加热回流法作为提取方法。本研究考察了以下实验条件：甲醇、体积分数为75%的甲醇、体积分数为50%的甲醇3种提取溶剂，30、60、90 min 3种提取时间，1∶10、1∶20、1∶30 3种药材与溶剂体积比，通过正交实验确定最佳提取条件，实验结果表明用药材与溶剂体积比为1∶20、体积分数50%甲醇加热回流提取90 min效果最佳，故用上述条件作为供试品溶液的制备方法。

本研究参考了部分咖啡酰奎宁酸类成分含量测定的色谱条件[17-19]，并在此基础上考察了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水、甲醇-甲酸水、甲醇-磷酸水4种流动相体系，同时比较了25 ℃和30 ℃ 2种色谱柱柱温，发现以甲醇-磷酸水为流动相、柱温30 ℃时，色谱峰的分离度及峰形最佳，能够满足含量测定的要求。

通过查阅文献，发现咖啡酰奎宁酸类成分在327 nm波长附近存在最大吸收，但因具体实验条件影响，导致在不同研究中所测定的最大吸收波长并不相同[20-22]。因此，本研究用配有二极管阵列检测器(PDA)的液相色谱系统对混合对照品溶液进行全波长扫描，以选取最佳检测波长，发现6种化合物均在327 nm波长处有最大吸收，但考虑到紫外检测器的重复性、基线平稳度优于PDA检测器，故本研究最终选择配有紫外检测器的液相色谱系统在327 nm波长下进行实验。

本实验用高效液相色谱法建立了藏龙蒿中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸C 6种有机酸类成分的含量测定方法，该方法快速、准确、稳定可靠，可为其质量标准的制定提供借鉴和参考。未来可以进一步对蒿属其他植物中有机酸类成分的含量进行研究，揭示藏龙蒿与同属其他植物有机酸类含量的差异，对其含量范围作出相应规定，以提高藏龙蒿的质量及其可控性，更好地发挥质量标准的本质意义。