β-蜕皮甾酮通过调控β-catenin/BMP表达促进骨髓间充质干细胞分化治疗骨质疏松性骨折的作用机制

莫亚峰 周坤 王徐刚 熊振飞 汤样华*

骨质疏松性骨折（osteoporotic fractures，OF）是骨质疏松最严重的并发症，流行病学结果显示，我国OF患者已达223万例，预计2050年将达到599万例[1-2］。人口老龄化导致骨质疏松症的患病率不断上升，并发骨质疏松性骨折的几率也相应增高。而现代医学研究已证实骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）、β-连环蛋白（β-catenin）在骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）成骨分化过程中起关键作用[3-4］。中药牛膝是中医骨伤科常用药物，具有补肝肾、强筋骨作用。本研究拟通过建立去卵巢骨质疏松性骨折小鼠模型、进行分组药物干预对照实验，以明确牛膝有效成分β-蜕皮甾酮是否可通过提高β-catenin/BMP表达水平，动员BMSCs的活性，促进其定向分化，发挥治疗骨质疏松骨折的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3个月龄TOPGAL小鼠50只，雌性，SPF级，质量（28.5±2.6）g，由上海中医药大学动物实验中心订购。实验动物饲养于上海中医药大学动物实验中心。所有小鼠在整个实验过程中均自由饮水和进食。

1.2 实验药物与试剂 β-蜕皮甾酮（上海诸德生物科技有限公司）；仙灵骨葆胶囊[国药准字Z20025337，规格：0.5 g/粒，国药集团同济堂（贵州）制药有限公司］，胶囊内容物与蒸馏水混合制成相应浓度混悬液；氯胺酮（西安力邦制药有限公司）；10%中性福尔马林（广州维格斯生物科技有限公司）；14%乙二胺四乙酸（EDTA）、苏木素染液，均购于北京百奥思科生物医学技术有限公司；盐酸乙醇分化液、伊红染液、甘油明胶封片剂、甲苯胺蓝染色试剂，均购于武汉谷歌生物科技有限公司；兔多克隆Anti-β-catenin、羊抗兔IgGBiotin，均购于英国abcam公司；DAB显色试剂盒，购于北京中衫金桥生物技术有限公司；超敏雌二醇试剂盒，购于西门子医学诊断产品（上海）有限公司；磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），购于美国Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA），购于碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器 超净工作台（AIRTECH公司）；电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；小型台式冷冻型离心机（德国Eppendorf公司）；SN-697γ计数器（上海核所日环光电仪器有限公司）；Micro-CT（瑞士Scanco Medical公司）；全自动免疫组化染色系统[丹科医疗器械技术服务（上海）有限公司］；VS120-SL全片组织扫描仪（美国Olympus公司）。

1.4 实验方法 （1）去卵巢骨质疏松性小鼠模型的建立[5］：选取3个月龄雌性TOPGAL小鼠，经氯胺酮（0.1g/kg）腹腔注射麻醉后，取俯卧位，选取肋弓下第3～4腰椎处作为手术入路，备皮后碘伏消毒，经腰背侧正中无菌操作下钝性分开腰部筋膜、肌肉，切开腹膜，分离、暴露卵巢，结扎输卵管和周围血管后摘除卵巢。随后以相同的方法摘除对侧卵巢。在确保双侧卵巢摘除后，逐层缝合腹膜至皮肤，庆大霉素注射手术切口。选取40只小鼠均按上述方法行双侧卵巢摘除。另外，随机选取10只小鼠进行假手术，不摘除卵巢，仅去除卵巢周围部分脂肪组织，作为假手术组；3个月后从行双侧卵巢摘除的40只小鼠中随机选取10只作为去卵巢组，与假手术组小鼠同时处死后进行指标检测（包括子宫重量测定、血清雌二醇水平测定和胫骨近端micro-CT扫描），以证实去卵巢骨质疏松性小鼠模型的造模成功。（2）骨质疏松性骨折小鼠模型建立[5］：选取30只去卵巢骨质疏松性小鼠，经氯胺酮（0.1 g/kg）腹腔注射麻醉后，取仰卧位，选取左侧胫骨备皮消毒，无菌操作下切开小鼠胫骨前缘皮肤1.5 cm，钝性分离胫骨内外侧组织，髓内针由胫骨平台处插入胫骨上1/3处时，使用手术剪避开胫骨内侧深部肌肉在1/3处完全横断胫骨后，髓内针头继续插入骨折断端下部骨腔约3/4长度时剪断，完成手术后逐层缝合。（3）分组与药物干预：将30只骨质疏松性骨折小鼠随机均分为空白对照组、β-蜕皮甾酮组和仙灵骨葆组，每组各10只。小鼠骨折术后第2天分别给予0.9%氯化钠溶液及相应药物0.5 mL灌胃治疗，1次/d，连续灌胃治疗4周后取材进行相关指标检测。（4）以放射免疫分析法测定血清雌二醇水平[6］：灌胃4周后，3组小鼠眼球取血处死，血液装入1.5 mL无菌EP管中，室温放置20～30 min，后于4℃下以3,000 r/min，离心15 min，分离出血清液移入新的EP管中，-80℃保存。将低温保存的血清液样本送至上海中医药大学核医学放射免疫实验室，由实验室工作人员使用超敏雌二醇试剂盒，SN-697γ计数器完成检测。（5）以影像学扫描（X线、Micro-CT）检测小鼠胫骨愈合情况[7］：灌胃4周后，3组小鼠眼球取血处死，立即取出左侧胫骨，剔除多余软组织；选取胫骨下段近关节处，剪断暴露骨髓腔（利于胫骨内骨髓固定），浸入10%中性福尔马林中固定48 h后予更换75%乙醇长期固定保存，分别进行X线及Micro-CT扫描，统一定位左侧胫骨上段1/3处，分辨率为18μm逐层扫描成像及三维重建。（6）β-蜕皮甾酮对β-catenin、BMP-7表达水平的影响：3组小鼠左侧胫骨Micro-CT扫描结束后，14%EDTA（PH7.4）进行脱钙处理3～4周，第1周更换脱钙液1次/d，第2～3周更换1次/2 d。X线确认脱钙完全后，再进行脱水、石蜡包埋处理，矢状位连续切片（4～5μm）。并对标本进行HE、免疫组化染色，使用Olympus VS120-SL采片、分析。①以苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色进行病理学观察分析[5，7］：石蜡切片60℃烤箱5 min，常规二甲苯脱蜡，经乙醇至水洗，吸干水后苏木素染液2 min，蒸馏水冲洗1 min，吸干水后盐酸乙醇分化5 s，氨水返蓝15 s，蒸馏水冲洗，吸干水后以伊红染液2 min，蒸馏水清洗。脱水后，梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性树胶封固，使用Olympus VS120-SL于20倍目镜下观察。②以免疫组化染色观察β-catenin、BMP-7的蛋白表达水平[5，7］：石蜡切片60℃烤箱5 min，常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗1 min，滴加甲醇：过氧化氢（1∶9），室温下孵育15 min，蒸馏水冲洗，滴加抗原修复液：蒸馏水（1∶50），高温高压至（105℃，0.025Kpa），自然冷却至室温，PBS洗片2 min×3次，5%BSA封闭20 min。37℃下滴加一抗（β-catenin：1%BSA 1∶500、BMP7：1%BSA 1∶200），4℃过夜后PBS洗片2 min×3次，滴加羊抗兔IgG-Biotin；37℃孵育15 min，PBS洗片2 min×3次，滴加SABC；室温15 min后，PBS洗片2 min×3次，滴加DAB显色液（蒸馏水1 mL+D1 50μL+D2 100μL+D3 50μL）；室温孵育3～10 min，梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性树胶封片，在Olympus VS120-SL 20倍目镜下观察。1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清雌二醇含量测定结果 β-蜕皮甾酮组及仙灵骨葆组血清中雌二醇含量均明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 药物对去卵巢小鼠血清雌二醇含量的影响[pg/mL，（±s）］

表1 药物对去卵巢小鼠血清雌二醇含量的影响[pg/mL，（±s）］

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，#P＜0.05

组别 雌二醇空白对照组 3.27±3.40 β-蜕皮甾酮组 8.14±4.19*仙灵骨葆组 12.23±4.92*#空白对照组

2.2 X线检测结果 空白对照组骨折端少量稀疏骨痂通过和少量外骨痂形成，骨折线可见；而β-蜕皮甾酮组和仙灵骨葆组骨折端外骨痂致密，部分髓腔再通，骨折线模糊。见图1。

图1 X-ray检测结果的比较

2.3 micro-CT扫描结果 空白对照组骨皮质厚度明显变薄，骨小梁稀疏、数量显著减少；β-蜕皮甾酮组与仙灵骨葆组骨皮质厚度明显优于空白对照组，骨小梁结构相对紧密、均匀。见图2。

图2 micro-CT扫描结果

2.4 HE染色结果 与空白对照组比较，β-蜕皮甾酮组和仙灵骨葆组小鼠骨小梁数量、密度均得到明显改善，骨痂形状更为规则，与骨皮质贴合程度更高，其中以β-蜕皮甾酮组效果最佳。见图3。

图3 骨组织HE染色（×20）

2.5 免疫组化染色结果 β-蜕皮甾酮组和仙灵骨葆组BMP-7、β-catenin表达阳性水平高于空白对照组，染色较深，但以β-蜕皮甾酮的密集度更高，染色更深。见图4。

图4 骨组织免疫组化染色（×20）

3 讨论

骨质疏松性骨折由于骨质量差和骨强度低易发生骨折延迟愈合或不愈合、骨折术后内固定松动等[8］。因此如何在治疗原发病的同时促进骨折愈合，缩短治疗周期，降低再次骨折发生率，是当前骨质疏松性骨折治疗的难点。目前临床上使用的药物以特立帕肽、双膦酸盐类等化学药物为主，临床使用中存在局限性和并发症[9-10］。

本研究结果显示，与空白对照组比较，β-蜕皮甾酮组、仙灵骨葆组能明显提高骨质疏松性骨折小鼠血清雌二醇水平（P＜0.05），但β-蜕皮甾酮组效果稍逊于仙灵骨葆组，表明β-蜕皮甾酮可以通过提高雌二醇含量实现抗骨质疏松作用。X线检测结果显示，空白对照组骨折端少量稀疏骨痂通过和少量外骨痂形成，骨折线可见；而β-蜕皮甾酮组和仙灵骨葆组骨折端外骨痂致密，部分髓腔再通，骨折线模糊。Micro-CT扫描结果显示，空白对照组骨皮质厚度明显变薄，骨小梁稀疏、数量显著减少；β-蜕皮甾酮组与仙灵骨葆组骨皮质厚度明显优于空白对照组，骨小梁结构相对紧密、均匀。表明，β-蜕皮甾酮能促进去卵巢小鼠骨质疏松性骨折的愈合，增加骨痂、骨量。

此外，在抗骨质疏松以及骨折愈合过程中，BMSCs成骨分化起重要作用。BMSCs成骨分化潜力是影响骨再生和重建的重要因素，当BMSCs更偏向于向脂肪细胞分化时骨形成明显减少则容易导致骨质疏松，甚至发生骨质疏松性骨折[11-12］。目前研究中，Wnt/β-catenin信号通路、BMP信号通路均被证明在调节BMSCs成骨分化中的发挥重要作用[13］。文献报道，在Wnt/β-catenin信号通路中，由Wnt蛋白参与形成的三聚体复合物可以阻止β-catenin蛋白磷酸化降解，β-catenin蛋白在细胞中的浓度升高，最终激活下游靶基因[14］。高表达的β-catenin蛋白可以促进BMSCs向成骨细胞分化[3］。而BMP信号通路则通常由BMP作为启动因子，促进下游Smad磷酸化，最终诱导BMSCs成骨分化[15］。且有研究证实，BMP-7是该信号通路的主要启动因子之一，可作为评价BMSCs分化能力的重要指标[4，16］。此外文献报道显示，Wnt/β-catenin信号通路与BMP信号通路在BMSCs成骨分化的不同阶段起协调作用[17］。为验证β-蜕皮甾酮是否可通过调控β-catenin/BMP通路发挥促进BMSCs成骨分化的作用，本研究通过比较各组小鼠胫骨HE染色及免疫组化染色后的β-catenin、BMP-7表达水平，发现β-蜕皮甾酮可有效增强去卵巢小鼠骨痂中BMP-7和β-catenin的表达，从而提高骨髓间充质干细胞分化能力，增加成骨细胞含量。

综上所述，β-蜕皮甾酮可通过增强BMP-7、β-catenin表达促进BMSCs定向分化，发挥治疗骨质疏松性骨折的作用。但本实验尚未揭露BMP-7和β-catenin是否具有上下游关系，需进行进一步研究。