SPME-GC-MS与SPME-GC-O协同鉴定菇娘果关键香气成分

刘子豪，王笑园，傅 娆，温 馨，倪元颖

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

菇娘果，又名毛酸浆（L.），为茄科（Solanaceae）茄族（Solaneae）茄亚族（Solaninae）植物，我国的主产区位于东北地区。菇娘果酸甜可口，风味独特，其作为东北地区的季节性水果深受当地消费者喜爱。研究发现菇娘果富含类胡萝卜素、多酚等功能活性成分，营养价值较高。随着越来越多的消费者对菇娘果营养价值的了解和对其独特风味的喜爱，以菇娘果为原料的罐头、饮料、果冻等产品逐渐变多，部分产品已推向国外市场。灯笼果（L.）与菇娘果同属茄科酸浆属，广泛种植于南美国家，并已成为了这些国家重要的出口农产品，创造了很高的经济价值，目前针对灯笼果中营养物质和香气特征的研究较多。然而，目前对菇娘果中营养成分的研究尚处于起步阶段，还没有针对菇娘果中香气物质的研究，其香气特征也与灯笼果较为不同，对其独特香气组分的研究将提供对菇娘果更全面的认识，有助于进一步开拓菇娘果及其产品市场。

食物气味占人类嗅闻所有气味的70%以上，指导人们进行食物喜好选择、质量判别、记忆唤醒等行为，因此研究天然食物的香气对探究人类气味质量感知机制具有重要意义。食物香气是复杂的混合物，截至2013年，Lesrghffingwell数据库统计共有7 100 种食物挥发性成分，但其中只有230 个成分是人对食物感知必要的，而人通过识别食物中的主要香气成分构建食物的气味图像，所以每种食物仅有3～40 个真正的主要香气成分。嗅觉产生的机理决定了香气分析的复杂性。人有339 种嗅受体基因，每个嗅觉神经元只表达一种嗅觉受体，但每种气味分子可以和多个嗅觉受体结合，每个嗅觉受体可以对多种气味分子反应，从而引起嗅觉神经元群体的组合反应。此外，香气物质之间的影响增加了混合香气分析的难度。相似的气味化合物混合会出现协同效应。两个气味不同的化合物混合会出现相互掩蔽现象，从而降低混合物感知强度，也会产生其中一个气味占主导的结果，如柠檬烯和香芹酮混合，柠檬烯会占主导。因此，难以从单一方面分析鉴定香气物质。

目前，食品香气成分的通用鉴定方法是气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法。GC-MS法可以对食品中挥发性成分进行定性和定量分析，使用GC-MS法时一般会结合使用气味活性值（odor activity value，OAV）鉴定食品中主要香气成分。OAV定义为香气物质的浓度与阈值之比，表示特定气味的效力，OAV＞1则被认为是主要香气。在仪器分析的基础上，结合感官组学分析技术可以有效鉴定食品挥发性成分中的关键香气成分，其中气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术已广泛应用于风味物质的研究。该方法通过对香气提取物进行稀释分析或魅力分析计算稀释因子（flavor dilution，FD）或魅力值（Charm），进而综合鉴定食品关键香气成分。林德洪等通过GC-MS结合GC-O分析金银花精油香味，根据FD值分析确定，苯乙醇（蜜甜花香）、异戊酸香叶酯（果甜香）、羟基香茅醛（青香）、芳樟醇（花青香）和壬酸烯丙酯（果香），是金银花精油的特征香味组分。张翼鹏等基于GC-O感官分析研究了西梅特征香气，确定乙位突厥烯酮、己醇、己醛、2-甲基丁醛、()-2-己烯醛、3-甲硫基丙醛是西梅主要特征性香气成分，同时发现不同品种西梅之间的香气成分有明显差异。仪器分析和感官组学分析技术相结合已成为鉴定食品关键呈香物质的有效方法。本研究拟采用顶空固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）技术萃取菇娘果香气成分，通过GC-MS定性定量分析菇娘果中挥发性成分，并进一步通过OAV法和GC-O法分别从仪器分析和感官分析方面综合分析鉴定菇娘果中关键香气活性物质。本研究将有助于了解形成菇娘果独特香气的风味组分，同时也将为菇娘果果汁等产品风味品质的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜成熟的菇娘果样品采自中国黑龙江省，冷链运输，去花萼、洗净、晾干，经真空冷冻干燥后研磨成粉末（干质量（15.4±0.03）%），装至锡箔袋充氮密封，贮存在-60 ℃冰箱备用。

辛二醇、己醛、2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮、甲硫基丙醛、2-甲基丁酸甲酯、C～C烷烃系列标品（均为色谱纯） 美国Sigma公司；聚乙二醇400（分析纯） 上海J.T.Baker公司。

1.2 仪器与设备

嗅闻仪 美国DATU公司；HP 6890气相色谱系统、7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、SU57348U DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取头、HP-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国安捷伦公司；FD-1A-50冻干机 北京博一康公司。

1.3 方法

1.3.1 菇娘果果浆的制备

顶空固相微萃取：基于Yilmaztekin报道的萃取方法，选用对挥发物具有较强吸附能力的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，将萃取头置于气相色谱的进样口老化，老化温度240 ℃，时间1 h，取出室温冷却10 min。将1.3.1节制备的菇娘果浆置于样品瓶磁力搅拌（300 r/min）平衡10 min，随后将萃取针插入顶空瓶中距液面1 cm处，室温（25 ℃）萃取60 min后缩回纤维头，迅速将针管插入气相色谱仪的进样口，240 ℃解吸。

1.3.2 GC-MS定性及定量分析

GC条件：进样口温度为240 ℃；载气（He）流速为1.0 mL/min；采用不分流进样模式；升温程序条件：初始温度35 ℃，保持3 min，以6 ℃/min升至225 ℃，之后保持3 min。

MS条件：采用全扫描模式采集信号，电子电离源，电子电离能量70 eV；接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描质量范围/35～500，扫描速率为5.2 次/s；质谱库为NIST08；无溶剂延迟。

挥发性物质的定性分析：首先通过质谱打出的离子峰碎片与NIST08中的谱库检索匹配，其次通过各物质在HP-5、WAX色谱柱上的线性保留指数（linear retention index，LRI）与NIST网站该物质的保留指数进行对比准定性。待测物质LRI根据上述运行程序得到的系列烷烃混合标样（C～C）的保留时间计算，公式如下：

式中：为色谱图中位于目标物质左侧正构烷烃的碳原子数；为位于目标物质两侧的正构烷烃碳分子数之差；、、分别为色谱图中待测物质、待测物质左侧和右侧正构烷烃的保留时间/min。

挥发物质的定量分析：采用内标法（内标为辛二醇，样品体系加入量为50 μL，质量浓度为1×10g/mL）对菇娘果中各挥发性成分进行相对定量分析，假设其相对内标校正因子为1，依据式（2）计算：

式中：C为挥发性物质含量/（μg/kg）；为内标物含量/μg（本实验中5 g果浆体系的添加量为1 g）；为实验所用菇娘果质量/g；A为挥发性物质峰面积；为内标物峰面积。

1.3.3 OAV法鉴定菇娘果中特征香气成分

在1.3.2节各种挥发性物质定量的基础上，参考各物质在水中的阈值，计算香气化合物OAV，公式如下：

式中：OAV为物质的香气活度值；C为菇娘果中物质的含量/（μg/kg）；OT为物质在水中的香气阈值/（μg/kg）。

当挥发性物质OAV≥1时被认为是菇娘果的特征香气物质。

1.3.4 GC-O法鉴定菇娘果中特征香气成分

菇娘果香气物质萃取方法同1.3.2节，GC条件同1.3.3节。

嗅觉检测器参数：嗅觉检测器接口温度为220 ℃，尾吹气流量60 mL/min，在嗅闻仪出口处配加湿设备以减少干燥气体对鼻黏膜的伤害。

嗅闻人员选择：嗅闻人员由4 名嗅觉功能正常、不吸烟且品评期间无感冒、鼻塞等干扰嗅闻状况的受试者组成，包括两男两女，均来自美国康奈尔大学食品科学系，实验前进行气味鉴别能力筛查以及操作培训。

嗅闻程序：基于Cunningham的方法进行如下操作，以1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16…为稀释度对进入嗅觉检测器的被测气体进行分流，直至嗅闻人员闻不到气味为止，一般需要进行5～8 次，所有稀释梯度都要至少嗅闻两次，嗅闻过程中嗅闻人员正常呼吸，记录每次嗅闻人员闻到的香气物质出现时间、持续时间及香气质量描述词。选取最后一次仍能闻到的香气物质作为菇娘果的特征香气物质，并通过标准品进行验证。以刚好闻不到气味的前一个稀释度为此香气的FD值，FD值表征香气成分对香气的贡献程度，FD值越大说明香气贡献越大。利用Charm分析对每位嗅闻人员的系列稀释结果进行分析，根据式（4）计算Charm值，计算公式如下：

式中：为Charm值；为稀释因子；为稀释次数。

1.4 数据处理

利用SPSS Statistics 21.0软件（内含ANOVA方差分析）对数据进行统计分析；所有图形采用OriginPro 2019绘制。

2 结果与分析

2.1 GC-MS法分析菇娘果挥发性化合物组分及含量

分别使用DB-WAX强极性色谱柱和HP-5弱极性色谱柱对菇娘果中挥发性成分进行分离，选取两个色谱柱中均检测到的物质，通过质谱和LRI值的双重判定，共检测到43 种挥发性组分，包括烷烃类5 种、醇类8 种、酚类2 种、醛酮类6 种、酸类3 种、酯类15 种以及呋喃类化合物4 种（表1）。从表1可以看出，菇娘果挥发性物质中酯类化合物最多，研究表明酯类化合物也是大多数新鲜水果中最主要的香气物质，其中含量最高的为2-甲基丁酸甲酯（（601.53±43.31）μg/kg）。其次是丁酸甲酯（（339.45±15.62）μg/kg），这种化合物也在同属酸浆属的灯笼果（L）中检测到。再次是己酸甲酯、丁酸甲基乙基酯、甲基-2-甲基丙酸酯，这些也均是灯笼果的主要成分。对于具有功能性的萜稀类化合物，在菇娘果中检测到-萜烯、-萜烯、4-萜烯醇，含量分别为（17.83±7.99）、（31.16±1.95）、（20.71±0.90）μg/kg。Mayorga等在灯笼果中也发现了-萜品烯；Dymerski等同样用顶空固相微萃取法检测到灯笼果中这3 种物质的含量分别为180、95、50 μg/kg；Yilmaztekin采用液液萃取法测定-萜烯和4-萜烯醇在灯笼果含量分别为13.2、128.5 μg/kg；Kupska等使用管内提取法测定其在灯笼果中的含量分别为53.6、9.78、68.6 μg/kg。醛酮类化合物中正己醛含量最高，为（90.79±12.57）μg/kg，除-紫罗兰酮在灯笼果检测到过外，其他均是菇娘果特有的挥发性成分。值得注意的是，呋喃类化合物在菇娘果挥发性物质中首次发现，但含量较少，总量约为60 μg/kg。文献报道在菇娘果的甲醇水提取物中鉴定出2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮的前体物质2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮己糖苷和2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮丙二酰基己糖苷，与本实验结果呈现一致性。通过匹对Flavornet和Perflavory香气数据库网站，发现2-戊基呋喃具有青豆、水果香，2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮具有焦糖香气，而2-戊烯呋喃和2,3-二氢苯并呋喃无香气。2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮广泛存在于多种食物中，尤其是水果，如菠萝、草莓、西红柿、荔枝等，其香气释放是由于成熟过程中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶作用于2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮糖苷将2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮释放，2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮还可以在甲基转移酶作用下合成2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2)-呋喃酮，两者均具有焦糖香气。在Berger和Dweck等的实验中均检测到灯笼果香气物质中含有2,5-二甲基-4-甲氧基-3(2)-呋喃酮。

表1 菇娘果的挥发性化合物成分及含量Table 1 Volatile compounds and relative contents in P.pubescens L.fruits

2.2 OAV法分析菇娘果特征香气成分

表2列出了采用OAV法鉴定出的菇娘果中10 种香气活性物质（OAV＞1），主要包括4 种醛酮类化合物（正己醛、甲硫基丙醛、反-2-顺-6-壬二烯醛、1-辛烯-3-酮），其香气分别描述为青草味、薯片味、黄瓜味、蘑菇味；5 种酯类化合物（2-甲基丙酸酯、丁酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、丁酸甲基乙基酯、癸酸甲酯），其香气分别描述为花香、果香、苹果香、刺激果香、葡萄酒香；1 种呋喃类化合物（2-戊基呋喃），其香气描述为焦糖味。从表2可以看到，OAV最高的为2-甲基丁酸甲酯，为136.71，这与其含量最高而阈值最低有关，该物质对多种水果的香气贡献均较大，如草莓、嘎啦苹果、甜瓜，同时它也在草莓果酒、干腌黑橄榄中表现出较大的香气贡献值。水果中拥有丰富的脂肪酸酯，被认为是贡献水果香气的重要成分，菇娘果中检出的甲基-2-甲基丙酸酯，虽然含量不高，但因为较低的阈值，OAV在酯类中排第二，这种花香物质曾在诺力果中被报道。丁酸甲酯和丁酸甲基乙基酯也是水果中常见到的主要香气物质，在桑葚和哈密瓜等水果中均有报道，其中丁酸甲基乙基酯也是羊奶的特征风味物质。癸酸甲酯也对菇娘果的香气有一定的贡献，其报道多见于果酒，由水果发酵生成，是葡萄酒、芒果酒的特征香气成分。菇娘果也存在不具有香气特征的酯类，如苯乙酸甲酯和十六酸甲酯，还有一些由于阈值过高，即使含量很高也导致OAV小于1，如己酸丁酯。同样，含量较高的萜稀类化合物也因阈值过高而导致OAV小于1。

表2 OAV法鉴定菇娘果的特征香气成分Table 2 Characteristic aroma components in P.pubescens L.fruits identified by OAV method

醛酮类化合物也是表征果香味的重要成分，甲硫基丙醛是仅次于2-甲基丁酸甲酯香气贡献程度的香气成分，其OAV为51.34，它也是奶酪的主要香气成分。反-2-顺-6-壬二烯醛具有黄瓜香气，曾报道在芒果香气中贡献较大。在利用OAV法分析土耳其灯笼果时发现具有青草味的己醛也是其主要香气成分，但其中OAV最高的是具有桃子香气的-辛内酯，而在本研究菇娘果中未检测到此种物质。在蔓越莓中也发现己醛和甲硫基丙醛具有较高的OAV。1-辛烯-3-酮是蘑菇的特征香气物质，由于具有较低的阈值而被检出。2-戊基呋喃在菇娘果中OAV为2.85，曾被认为是红烧鸡、草鱼的特征香气物质。

2.3 GC-O法分析菇娘果特征香气成分

根据4 位嗅闻人员嗅闻结果，对每一位嗅闻人员每个稀释度的品评结果进行Charm分析，以保留指数为横坐标，FD为纵坐标作图，得到Charm图（图1）。

图1 4 位嗅闻人员的菇娘果香气Charm图Fig.1 Charm plots of aroma components of P.pubescens L.fruits identified by four panelists in GC-O

图中每一种香气峰的高度代表FD，面积代表Charm值。从图1可以看出，嗅闻结果具有个体差异性，当不分流稀释时嗅闻人员可以识别菇娘果中19～45 种香气成分不等，随着稀释倍数的增加，嗅闻人员闻到的香气种类越来越少。将每个人最后一个稀释度仍能闻到的物质视为菇娘果的特征香气成分，结果如表3所示。从表3可以看出，不同的嗅闻人员有不同的检测阈，嗅闻人员MQ的嗅觉灵敏度最高，FD最高为128。嗅闻人员KD的嗅觉灵敏度最低，FD最高仅为16。在最高稀释度下，嗅闻人员只能闻到1～2 种气味成分，嗅闻人员XW鉴定出的主要香气成分为“苹果味”2-甲基丁酸甲酯和“薯片味”甲硫基丙醛，嗅闻人员SS鉴定出的主要香气成分为“薯片味”甲硫基丙醛和“青草味”己醛；嗅闻人员KD鉴定出的主要香气成分为 “青草味”己醛和“薯片味”甲硫基丙醛；嗅闻人员MQ鉴定出的主要香气成分为“薯片味”甲硫基丙醛。“薯片味”甲硫基丙醛是4 位嗅闻人员在最后一个稀释度下共同鉴定出的香气物质。同时其他两种香气成分均在嗅闻人员上一个稀释度上出现，这表明每个人对不同物质的阈值不同。Lin Hongbin等利用香气提取物稀释分析法得出甲硫基丙醛是豆瓣酱中最具有代表性的特征香气成分。而2-甲基丁酸甲酯在富士苹果和菠萝中均具有较高的FD值。虽然3 种香气成分在各类食物中均有报道，但仍未见其在其他食物中共同出现。

表3 GC-O法鉴定菇娘果的特征香气成分Table 3 Characteristic aroma components in P.pubescensL.fruits identified by four judges

2.4 OAV法与GC-O法鉴定菇娘果特征香气成分的比较分析

对比OAV法与GC-O法分析的菇娘果特征香气成分，均含有2-甲基丁酸甲酯、甲硫基丙醛和己醛，表明两种方法具有一致性。但也可以看到两种方法得到的每个化合物对菇娘果香气的贡献程度存在差异，如己醛的OAV为1.24，并不是OAV最高的3 个香气物质之一，但在GC-O法中被鉴定为3 个主要香气物质之一。OAV法检测出的反-2-顺-6-壬二烯醛和1-辛烯-3-酮均可以被嗅闻人员闻到，但是在GC-O法测定的最后两个稀释度都没有闻到。值得注意的是，作为菇娘果的特征化学成分2,5-二甲基-4-羟基-3(2)-呋喃酮，其OAV由于浓度较低而小于1，但在GC-O法分析时嗅闻人员KD、XW、SS在倒数第2个稀释度仍可以闻到，而嗅闻人员MQ对其阈值较高，因此在倒数第2个稀释度就闻不到了。这些差异性可能与OAV法所用阈值来自文献，与本实验实际情况具有较大差异性有关。

OAV法没有考虑到基质的影响，而基质对气味化合物的挥发性及其在食品上方高度空间的浓度有影响，从而导致阈值的差异性。不同个体阈值大小也会存在差异。同时，化合物之间存在协同或抑制的相互作用，OAV设定的前提为食物香气强度是每种香气成分的属性简单相加，实际OAV与浓度的线性关系存在很大变异性，这样可能会造成一些OAV＜1的物质由于与其他物质发生协同而可能会被人们感知，一些OAV＞1的物质由于抑制效应而可能不会被人们感知。Escudero等通过遗漏实验证明葡萄酒的主要香气物质为4-巯基-4-甲基-2-戊酮，但其OAV仅为2。因此，仅利用OAV法预测特征香气成分具有一定的局限性。

GC-O法利用人鼻作为一种最灵敏、最具选择性的生物检测器，通过嗅探技术对色谱流出液中挥发物进行了气味检测，免去了测定食物中所有挥发性物质含量的操作，针对性地分析可以被人类察觉到的香气物质，缩小了鉴定范围，但人们对其“FD高的物质对食物的特征香气贡献就大”的定论存在一定质疑。此外，嗅闻人员的呼吸频率与鉴定结果有相关性，呼吸频率较快的受试者检测到的香气成分会较多，因此对气相分离程序和嗅闻人员的反应灵敏度也提出了更高的要求。

总之，OAV法和GC-O法均基于阈值评价气味强度，OAV法采用仪器分析，其成本较低，可以对特征香气成分进行初步确定，而GC-O法是仪器分析与感官分析的结合，其结果更加准确。综合使用两种方法，确定菇娘果的特征香气为2-甲基丁酸甲酯、甲硫基丙醛和己醛。

3 结论

以菇娘果为研究对象，对其挥发性成分和主要香气成分进行探究，主要通过GC-MS对菇娘果挥发性成分进行定性定量分析，通过OAV法和GC-O法对菇娘果中具有香气贡献能力的香气活性物质进行鉴定。利用GC-MS法，首次检测出菇娘果中43 种挥发性组分，包括烷烃类5 种、醇类8 种、酚类2 种、醛酮类6 种、酸类3 种、酯类15 种以及呋喃类化合物4 种。酯类化合物总量最多，其中含量最高的为2-甲基丁酸甲酯（（601.53±43.31）μg/kg）。OAV分析结果表明，菇娘果中有10 种主要香气活性物质（OAV＞1），其中2-甲基丁酸甲酯、甲硫基丙醛、甲基-2-甲基丙酸酯OAV最高，分别为136.71、51.34和14.41。GC-O法将最后一个稀释度下嗅闻人员仍可闻到的气味定义为特征香气组分，4 名嗅闻人员对菇娘果特征香气成分的鉴定为“苹果味”2-甲基丁酸甲酯、“薯片味”甲硫基丙醛和“青草味”己醛。OAV法与GC-O法分析的菇娘果特征香气成分均含有2-甲基丁酸甲酯、甲硫基丙醛和己醛，表明两种方法具有一致性，但同时也存在一定差异性。本研究对菇娘果香气的特征成分进行了系统性的鉴定，为菇娘果果汁、果粉或食用香精等产品的开发提供理论依据。