七叶皂苷钠对肝癌细胞迁移黏附能力的影响*

李湘波 田 睿 贺小俭

长沙市第三医院 (湖南 长沙， 410015)

原发性肝癌(PHC)是一种易转移、侵袭性高且具有较高发病率的恶性肿瘤，死亡率是全球恶性肿瘤死亡率第2位，仅次于肺癌[1]。PHC有着较高的复发率，手术后5年复发率为60%左右[2]。寻找一种能够抑制PHC发生和发展的药物是PHC治疗的一个重要方向[3]。七叶皂苷钠提取于中药婆罗子，能够纠正脑功能失常、保护血管、抗氧化和抗炎，具有较高的临床应用价值[4]。有研究表明七叶皂苷钠能够抑制肝癌细胞增殖[5]，但对肝癌细胞迁移和黏附能力的作用还有待研究，本研究应用七叶皂苷干预HepG2肝癌细胞，研究其对肝癌细胞迁移、黏附能力的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 七叶皂苷钠购自ChemFaces；琼脂粉由北京索莱宝有限公司提供；DMEM高糖培养基由HyClone公司提供；胎牛血清(FBS)由Gibco公司提供；HepG2人肝癌细胞购自大连美伦生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含有10% FBS和1%双抗的DMEM高糖培养基，37℃、5% CO2条件下培养。

1.2.2 细胞缓慢聚集实验 取对数生长期HepG2细胞，待细胞生长至70%融合时，分别加入低浓度(20 μmol/L)、中浓度(40 μmol/L)、高浓度(60 μmol/L)七叶皂苷钠，孵育48 h后消化细胞并转移至铺有琼脂的96孔板中，每组重复5孔，在培养箱中继续孵育12 h，观察细胞聚集情况并拍照，计数细胞团数。

1.2.3 细胞分离实验 取对数生长期细胞，待细胞生长至70%融合时，分别加入低浓度(20 μmol/L)、中浓度(40 μmol/L)、高浓度(60 μmol/L)七叶皂苷钠，孵育48 h后消化细胞并且转移至48孔板中，每组重复10孔，细胞长满后分别用含1 mmol/L CaCl2的0.2%胰酶(TC)、含1 mmol/L EDTA的0.2%胰酶(TE)消化细胞，镜下观察并计数细胞团数(N)和单个细胞数，计算细胞分散程度(NTC/NTE)。

1.2.4 划痕实验 取对数生长期细胞，待细胞生长至70%融合时，分别加入20、40、60 μmol/L七叶皂苷钠，孵育24 h后消化细胞并按大于109个/L密度接种在培养皿中，细胞长满后用吸头尖端在培养皿中划痕，PBS清洗2次后加入无血清培养基，培养48 h后镜下观察、拍照，采用Image J软件测量划痕宽度。

1.2.5 Western blot方法检测E-cadherin蛋白表达 取对数生长期细胞，待细胞生长至70%融合时，分别加入20、40、60 μmol/L七叶皂苷钠，孵育48 h后加入细胞裂解液，置于冰上裂解40 min，12 000 rpm离心20 min，收集上清液，测定总蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白，然后转移到0.45 μm的NC膜上，室温下含5%脱脂奶粉的TBS封闭3 h，然后分别加入β-actin和E-钙黏蛋白(E-cadherin)一抗，放置于4℃摇床中过夜，PBS洗膜3次后加入相应二抗，室温孵育2 h，PBS洗膜3次后进行ECL化学发光，采集图像并计算E-cadherin相对表达量。

1.3 统计学方法 所有数据均使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计数资料用例(%)表示，组间比较采用独立卡方检验；计量资料用(均数±标准差)表示，组间比较采用成组t检验。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 七叶皂苷钠对HepG2细胞聚集能力的影响 对照组细胞团块体积小，数量多且疏松。随着七叶皂苷钠浓度的升高，细胞团块的体积有所增大，数量减少但致密度增加。经过计数分析，低浓度实验组细胞团数为24.19±2.94，中浓度实验组细胞团数为13.93±3.18，高浓度实验组细胞团数为2.14±1.01，均低于对照组细胞团数(64.28±6.83，P<0.05)，且不同浓度实验组制剂细胞团数差异具有统计学意义(P<0.05)，表明随着七叶皂苷钠浓度的升高，HepG2细胞的聚集能力增强。见图1。

2.2 七叶皂苷钠对HepG2细胞黏附能力的影响 与对照组比较，应用含1 mmol/L CaCl2的胰酶处理细胞后，不同浓度实验组细胞形成的团块体积较大(P<0.05)，且细胞团块体积大小与药物浓度成正比；应用含1 mmol/L EDTA的胰酶处理细胞后，各组细胞均分散为单个细胞，且分散度相似(P>0.05)。镜下计数并计算，低浓度实验组NTC/NTE为0.50±0.06，中浓度实验组NTC/NTE为0.35±0.03，高浓度实验组NTC/NTE为0.16±0.04，均小于对照组(0.90±0.09，P<0.05)，不同浓度实验组NTC/NTE随药物浓度升高而降低(P<0.05)，说明HepG2细胞间黏附能力随药物浓度增加而增强。见图2。

2.3 七叶皂苷钠对HepG2细胞迁移能力的影响 划痕后各组细胞的划痕宽度相似(P>0.05)，孵育24 h后对照组细胞划痕宽度明显缩小，不同浓度实验组细胞划痕宽度均宽于对照组，且划痕宽度随药物浓度升越高而增大(P<0.05)，说明HepG2细胞的迁移能力因药物作用而受限，迁移能力受限程度随着药物浓度升高而加重。见图3。

2.4 七叶皂苷钠对HepG2细胞E-cadherin蛋白表达的影响低、中、高浓度实验组细胞E-cadherin蛋白相对表达量分别为0.52±0.02、1.02±0.06、1.93±0.31，均显著高于对照组(0.43±0.03，P<0.05)，且不同浓度实验组细胞E-cadherin蛋白相对表达量随药物浓度升高而增加(P<0.05)。见图4。

3 讨论

七叶皂苷作为一种临床上广泛应用的消炎祛肿的药物，有研究显示其能到抑制乳腺癌的发展和生长，前期研究表明七叶皂苷钠能够作用于NK-kB信号通路从而对癌症细胞的增殖进行抑制[6]。前期研究曾表明七叶皂苷钠对肝癌细胞的抑制效果与临床上常用的索拉菲尼相似，对肝癌细胞具有抑制增殖的作用[7]。但是其对肝癌细胞的迁移和粘附能力是否有影响还有待研究[8]。本研究便应用不同浓度的七叶皂苷钠对HepG2细胞进行干预，研究其对肝癌细胞迁移和粘附的影响，为七叶皂苷钠抑制肝癌转移提供基础资料。

细胞行为的改变与肿瘤的发展和发生有着重要的关系[9,10]。前期研究表明，肿瘤发生转移和迁移的首要原因是肿瘤细胞间的黏附力下降，其中钙黏蛋白作为一种钙依赖性跨膜糖蛋白，其对介导细胞间的同质黏附有着重要的作用[11,12]。但细胞内的钙依赖性跨膜糖蛋白失活时，肿瘤细胞即可能脱离原发病灶位置转移到其它位置发生肿瘤转移[13,14]。本项研究中应用细胞分离试验和细胞缓慢聚集实验对七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2细胞间粘附力的影响进行研究。其中细胞分离试验主要是考虑到细胞内钙依赖性跨膜糖蛋白对Ca2+存在明显依赖性而设计的实验，通过应用含有CaCl2和EDTA的胰酶对细胞进行处理[12,15]。其中Ca2+能够与EDTA发生明显的螯合作用，降低Ca2+浓度，从而对钙依赖性跨膜糖蛋白所介导的细胞间黏附作用进行抑制，从而细胞连接出现破坏，从而分散为单个细胞[16]。当应用含有Ca2+的胰酶对细胞进行处理后，大量的Ca2+能够促使钙依赖性跨膜糖蛋白的黏附力正常发挥，细胞间的黏附力增大，细胞聚集形成团块[17]。简单来说，钙依赖性跨膜糖蛋白的功能越强，细胞黏附能力越强，容易聚集形成团块[18]。NTC/NTE被用于对钙依赖性跨膜糖蛋白的功能进行检验，NTC/NTE的值越大，钙依赖性跨膜糖蛋白的功能越弱，从而细胞间的黏附能力越弱。细胞聚集实验是通过在培养皿中加入琼脂从而对细胞悬浮的状态进行模拟，从而判断悬浮细胞聚集成团情况，通过对细胞聚集成团的数量和大小对细胞间粘附力的大小进行判断[19]。细胞粘附力越弱，细胞聚集成团数量越少，细胞团块疏松且体积较小，当细胞粘附力较强，则细胞成团紧密体积较大且成团数量多。

细胞实验显示，本研究应用七叶皂苷钠干预后，相较于对照组，实验组细胞的聚集能力明显增强(P<0.05)，细胞分散能力、迁移能力则降低(P<0.05)，作用随药物浓度升高而增强，其作用机制可能与促进E-cadherin蛋白表达有关。研究结果提示，七叶皂苷钠能够增强HepG2人肝癌细胞的同质黏附力，抑制肿瘤细胞迁移。