上海地区苏云金芽孢杆菌的分离及其对草地贪夜蛾室内杀虫活性的测定

陈诗杰,曹越平

(上海交通大学农业与生物学院,上海 200240)

苏云金芽孢杆菌广泛分布于土壤中,国内学者近年来从各地土壤样品中分离得到对某些害虫具有高毒力的Bt菌株,其杀虫谱各异[9-11]。上海属长江下游冲积平原,土壤类型以水稻土、潮土、滨海盐土为主[12],目前对当地的苏云金芽孢杆菌资源的搜集工作鲜见报道。本研究以分离自上海地区土壤样品中的Bt菌株为主要对象,通过伴孢晶体蛋白形态观察、16S rDNA序列及cry基因类型鉴定和SDS-PAGE蛋白分析,并以草地贪夜蛾为受试昆虫,筛选出具有高毒杀活性的Bt菌株,以期进一步丰富苏云金芽孢杆菌菌株的资源储备,并为促进Bt生物制剂的可持续应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 土壤样品的采集与Bt菌株的分离

遴选上海市26个地区挖取地表下5—10 cm处土壤50 g,共计165份,记录经纬度、植被情况等采样信息。预处理后利用NaAc-抗生素筛选法[13]进行Bt菌株的分离,镜检观察后根据采集地点和分离顺序予以编号。菌株经平板划线增殖后制备成甘油菌保存。

1.2 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的形态观察

将筛选到的Bt分离菌株划线于1∕2 LB培养基上,28℃恒温培养72 h,每4 h定期涂片,石碳酸复红染色后100×油镜镜检,观察晶体形态、大小、数量。

1.3 16S rDNA序列测定

从平板纯培养物挑取单菌落提取总DNA,经紫外分光光度计检测其浓度后作为PCR反应模板,引物为16S rDNA通用引物27F和1492R。20 μL PCR反应体系如下:LA Taq(TaKaRa)0.2 μL,引物27F(10 μmol∕L)和1492R(10 μmol∕L)各1 μL,DNA模板1 μL,dNTP Mix 3.5 μL,Buffer II 4 μL,RNase-Free Water 5.3 μL。反应程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,30个循环;72℃延伸10 min。经琼脂糖凝胶检测后将PCR扩增产物回收纯化,连接pMD18-T载体(TaKaRa)后转化DH5α大肠杆菌细胞(TaKaRa),挑取阳性克隆测序。将测序结果上传至NCBI进行BLAST比对,根据分析比对结果构建系统发育树,进一步确定Bt菌株。

1.4 Bt分离菌株cry基因类型的鉴定

1.4.1 Bt质粒的提取

Bt质粒提取方法参见文献[14]。

1.4.2cry基因类型的PCR-RFLP鉴定

以质粒DNA为模板,利用Kuo等[15]和张杰等[16]根据cry基因序列特点设计的通用型引物(共16对),对Bt分离菌株进行cry1—3、cry5—9、cry11、cry18—22、cry30、cry32及cry40基因类型的鉴定。

财政事权与支出责任划分，西方彻底分权的划分模式中国目前不具备相应的先决条件，应在“中央决策、地方执行”的框架下推进，可考虑按照事权要素的划分，中央决策、地方执行，但是中央的决策权再进一步细分，决策可分为“做什么”和“做到什么程度”，在“做什么”权力保留在中央政府的前提下，“做到什么程度”是可给地方的自主权。同时强化科学的绩效考核机制，提升地方履行事权的效率和效果。

1.5 伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE分析

挑取Bt单菌落置于10 mL LB液体培养基中,30℃培养至形成伴孢晶体,取1 mL培养液于1.5 mL离心管中超声波破碎。取100 μL样品,加入25 μL新配的0.5 mol∕L NaOH,25℃反应5 min,加入50 μL 2×上样缓冲液,100℃煮沸5 min,12 000 r∕min离心1 min,去沉淀,取10 μL上样,130 V恒压电泳,脱色后观察蛋白条带。

1.6 对草地贪夜蛾室内杀虫活性的测定

1.6.1 生测样液的制备

挑取Bt单菌落于30℃、200 r∕min恒温振荡条件下培养过夜,以1∶100比例转接于1∕2 LB培养基中,培养至大部分晶体释放,12 000 r∕min离心收集孢晶混合物,用1 moL∕L冰冷的NaCl洗涤3次,再溶于无菌水中,并调整菌悬液浓度得到100倍液,于-70℃保存备用[17]。

1.6.2 室内杀虫活性测定

草地贪夜蛾为室内人工饲养[18];采用表面覆盖法对饲料进行处理,饲料中加入待测样液后充分搅拌均匀,室内阴凉处晾干备用。

灭菌养虫管中每管轻轻接入初孵幼虫10头,处理饲料2 g,3次重复,以16 000 IU∕mg苏云金杆菌粉剂处理为阳性对照,无菌水处理为阴性对照;置于适宜条件饲养[19],每日观察虫体和饲料情况,保证管内清洁及透气性。

培养72 h后调查死虫数,计算平均死亡率和校正死亡率。

2 结果与分析

2.1 上海地区不同用地类型中Bt菌株的分离

对采集自上海市26个地区共计165份土壤样品进行处理,共分离得到芽孢杆菌610株,经鉴定得到苏云金芽孢杆菌50株,总检出率为8.20%。如表1所示,不同用地类型的Bt检出率有所差异。其中,采自吴泾工业区的土壤样品检出率最高,达21.62%;其次为宝山工业园区,检出率为5.41%;居民住宅区及两大高架路段的样品检出率相对较低,均在4%以下。

表1 不同用地类型土壤样品中Bt菌株的分离结果Table 1 Isolation results of Bt strains in soil samples of different land use types

2.2 Bt分离菌株伴孢晶体结构的观察

利用光学显微镜对50株芽孢杆菌进行观察,发现所含的伴孢晶体形态多数含有菱形、球形和不规则形3类,以球形晶体为主,其中菱形晶体12株,球形晶体33株,不规则晶体3株,分别占比24.0%、66.0%和6.0%。光学显微镜下观察到的各晶体形态见图1。

图1 100×油镜下观察到的Bt分离菌株伴孢晶体形态Fig.1 Parasporal crystal morphology of the associated Bt strains observed under oil microscope(100×)

2.3 Bt菌株的16S rDNA鉴定分析

在对50株Bt分离菌株进行16S rDNA序列测定中,将菌株XX2的16S rDNA基因序列提交NCBI后经BLAST比对分析,发现其与已登录的编号为KJ676099.1的苏云金芽孢杆菌同源性最高,达到99%。将比对后同源性最高的6个结果构建系统发育树(图2),可进一步判断菌株XX2为芽孢杆菌属的苏云金芽孢杆菌。

图2 依据16S rDNA序列同源性构建的Bt菌株XX2系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Bt strain XX2 based on 16S rDNA sequence homology

2.4 Bt菌株的cry基因类型鉴定

利用PCR-RFLP体系对50株Bt菌株进行cry基因类型鉴定,部分菌株PCR扩增及酶切(PstI、XbaI)结果如图3所示。结果表明:50株Bt菌株cry基因类型丰富,大部分菌株可成功扩增出cry基因片段,且所含cry基因类别各有差异,包含cry1、cry3、cry8等共16种基因类型。其中,包含cry32类基因的菌株有31株,覆盖度达62%;其次为包含cry8类基因的菌株有25株,覆盖度达50%。对cry1类基因的酶切结果显示,在第三等级水平下,鉴定出的cry1类基因主要有cry1Ab和cry1Ac,分别占含cry1类基因总菌数的58.83%和29.41%。部分分离菌株所含cry基因类型见表2。

图3 cry1类基因的引物K5un2∕K3un2 PCR扩增及酶切Fig.3 PCR amplification with primers K5un2∕K3un2 and digestion of cry1 gene

2.5 伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE分析

如图4所示,Bt分离菌株伴孢晶体蛋白的分子量大小从45 ku到130 ku不等,菌株大都表达130 ku蛋白。其中,菌株PD1表达约65 ku的蛋白;XX2与DX4表达50 ku、45 ku的蛋白;BS3与DX4菌株均表达80 ku蛋白;XX2、WJ3、PD1、DX4和WJ29菌株表达情况相似,均表达90 ku的蛋白。Bt菌株电泳带型图谱的不同,印证了Bt菌株的多样性。

图4 部分Bt分离菌株伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE电泳分析Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis analysis of parasporal crystal protein of some Bt strains

2.6 对草地贪夜蛾室内杀虫活性的测定

利用50株Bt分离菌株对草地贪夜蛾一龄孵出幼虫进行室内杀虫活性测定,部分菌株测定结果见表2。菌株BS3与PD1对草地贪夜蛾的杀虫活性最高,72 h处理其校正死亡率达到100%,菌株WJ3与DX4对草地贪夜蛾的校正死亡率达到90%以上,分别为93.13%与96.56%,属于高毒力菌株,菌株XX2、WJ29对草地贪夜蛾的致死率在75%—90%,其余Bt菌株对草地贪夜蛾的杀虫活性较低或没有杀虫活性。

表2 部分Bt分离菌株的cry基因类型及对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性Table 2 Cry genotypes of some Bt isolates and their insecticidal activity against S.frugiperda larvae

3 讨论

土壤是苏云金芽孢杆菌主要的分布场所,本研究从上海市165份土壤样品中共分离得到Bt菌株50株,不同用地类型的Bt分离率各有差异,依次是工业园区＞生态湿地＞交通主干道＞居民住宅区,这可能与苏云金芽孢杆菌所在的生态环境包括土壤pH、植被覆盖度、空气环境污染物等条件有关[20]。由于工业园区常进驻制造加工业、石油化工业等产业,长期以来可能对当地土壤中的重金属含量、气体成分等造成一定影响[21]。苏云金芽孢杆菌的分布与该类土壤环境之间的具体关系尚不明确[22-24],或许在环境治理、重金属污染等方面具有潜在应用价值。

苏云金芽孢杆菌内生质粒丰富[14],不同的cry基因类型所编码的杀虫晶体蛋白具有不同的杀虫活性,蛋白大小与形态通常也与cry基因类型存在关联。对鳞翅目害虫有毒杀活性的有cry1、cry2和cry9类基因所编码的杀虫晶体蛋白,多为130 ku、60—65 ku的菱形蛋白;cry3、cry8类基因的晶体蛋白对鞘翅目害虫表现出高毒杀活性,多为130 ku、70 ku的球形蛋白;cry30、cry32类基因的晶体蛋白则对双翅目害虫表现出杀虫活性,多表达130 ku的球形蛋白[4]。本研究通过PCR-RFLP体系对分离的50株Bt菌株进行cry基因类型鉴定,结果显示分离菌株涵盖有cry1—3、cry5—9、cry11、cry18—22、cry30、cry32和cry40共16种基因类型,其中cry8、cry32两类基因类型检出比例较高,分别达到50%及62%,与光学显微镜下观察到的以球形晶体蛋白为主的形态结果相吻合。

草地贪夜蛾已在多个国家经历化学农药及生物制剂的防治阶段[25],对多种药剂产生了不同程度抗性,且对表达cry1F蛋白的商业化Bt玉米‘TC1507’产生田间抗性[7-8],此外,对于连年种植的cry1Ab、cry1Ac等Bt玉米也存在产生抗性的风险[26]。为筛选出高毒力Bt菌株,进而开发稳定的Bt产品,国外学者通过室内筛选得到高毒力Bt菌株S1905与BR45,经鉴定两者含有cry1Aa、cry1Ab,cry1Ac、cry1B和cry2Aa等杀虫基因[27-28]。李国平等[29]测定了几种Bt蛋白对草地贪夜蛾初孵幼虫的致死作用,以Vip3A和cry1Ab基因编码的蛋白毒力较高。本研究通过室内饲喂法筛选出对草地贪夜蛾杀虫活性较高的6株Bt菌株,杀虫活性均在75%以上,其中菌株XX2、WJ25、PD1和DX4均含有对鳞翅目具有杀虫活性的cry类基因,如cry1Ab、cry1Ac等。其他菌株没有检测出相关基因,却表现出对草地贪夜蛾的高杀虫活性,尤其是菌株BS3,72 h处理的校正死亡率达到100%。由于苏云金芽孢杆菌产生的生物活性物质种类多样[30],上述菌株是否存在对草地贪夜蛾敏感的杀虫活性物质如Vip3A蛋白、双效菌素等,仍需要后期进一步鉴定。另外,本研究在理论上验证了Bt分离菌株对草地贪夜蛾具有室内杀虫活性的可行性,与田间草地贪夜蛾幼虫的生存环境还存在一定差异,故田间使用上述菌株时是否会产生同样效果,尚需进一步验证。本试验所筛选的Bt菌株可为苏云金芽孢杆菌资源的进一步研究与利用提供参考。