钛合金磨粒流加工表面细胞黏附研究①

张利 应荣敏 陈国达 黄一 单晓杭

(浙江工业大学机械工程学院 杭州310032)

0 引言

随着年龄增长,骨组织极易损伤且力学性能退化[1]。对于55 岁以上的人群,骨关节病发病率达到了80%,严重会导致关节活动能力丧失,生活不能自理。目前,使用医用材料进行损伤关节替换的人工关节置换术是治愈关节疾患终末期的最有效手段。钛合金具有良好的力学性能与生物相容性,是现有医用内植入产品的首选材料[2-3],但钛合金表面硬度较高、工艺性较差,使其复杂曲面的表面加工困难,存在加工均匀性差、效率低的问题。

关节置换术实施后,医用材料与活体组织是直接接触的,因此材料的生物相容性、毒性、耐用性尤为重要,即需确保人工关节使用中对人体是安全的[4]。细胞黏附即细胞附着于植入体的过程,是植入体进入人体后所有生物学行为的第一步,有了良好的黏附基础,细胞随后的增殖、分化、迁移和凋亡才能正常进行[5]。细胞与底物之间的黏附过程为底物吸附细胞外介质中的离子和水,继而吸附其中的黏附类蛋白,形成蛋白聚集层后,细胞通过离子键、范德华力等弱作用力附着在材料表面。植入体的化学组成,决定了材料的亲疏水性,植入体表面形貌的变化又会使其具有不同表面力场、表面电荷及表面能[5-6]。过于粗糙的植入体表面会引起血凝,磨损会产生微小颗粒[7],而过于光滑的表面,与组织接触易形成炎症。目前生物材料粗糙度研究范围为10 nm～10 μm,该尺寸对细胞与生物材料表面的相互作用影响较大。

本文基于仿型流道磨粒流技术加工4 组Ti6Al4V 钛合金薄片表面,并进行体外细胞黏附对比实验,观察磨粒流加工后薄片表面的微观形貌特征,探索适宜MC3T3-E1 细胞黏附的表面粗糙度,对于钛合金人工关节表面处理及其生物相容性的相关研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 钛合金薄片处理及检验

1.1.1 加工方法

仿型流道磨粒流表面加工技术原理图如图1所示[8],利用仿型约束构件与钛合金工件表面共同组成一条厚度均匀的加工约束流道,在泥浆泵的作用下磨粒(SiC)体积分数在0.1～0.3 之间的软性磨粒流从流道入射口流入[9-10],根据流动特性流体进入约束流道后发展为湍流状态并填充满整个流道[11]。其中磨粒在液相载体作用下做无规则随机运动并且不断冲击被加工件表面,实现微量微力的微切削作用,从而实现对关节复杂表面的精密加工。

图1 覆盖式磨粒流加工原理图

选用Ti6Al4V 的钛合金圆薄片作为实验品,厚度为1 mm,直径为10 mm。将钛合金分为4 组,每组20 片,表面粗加工使用砂纸抛光至粗糙度Ra约为0.23 μm,精加工分别采用磨粒粒径为8 μm、10 μm、13 μm 和18 μm,体积分数为0.1 的软性磨粒流进行加工,加工时长5 h。

1.1.2 表面形貌观察及粗糙度测量

采用KEYENCE VW-60 动态分析三维显示系统,对钛合金抛光前及不同粒径磨粒流抛光后的表面形貌进行观察。

采用Mitutoyo 粗糙度仪测量钛合金片的表面粗糙度Ra。测量方法是在各个钛合金片上取5 个点进行测量,结果取其平均值。

1.2 细胞黏附实验与检测

1.2.1 材料

主要仪器:二氧化碳培养箱(Thermo,美国)、倒置显微镜(Olympus,日本)、酶标仪(华东电子,中国)、低速台式离心机(Anke,中国)。

主要试剂:0.25%胰蛋白酶溶液、DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)培养液、胎牛血清,二甲基亚砜(DMSO),磷酸盐缓冲液(PBS),5 mg/ml噻唑蓝(MTT)溶液。

细胞:MC3T3-E1 小鼠成骨细胞,由国家实验细胞共享服务平台提供。

1.2.2 细胞复苏与传代

无菌条件下将MC3T3-E1 细胞从-80 ℃低温环境取出,置于37 ℃的水浴中复温,不断摇动,完全融化后,取1 ml 冻存悬液至离心管,1000 r/min 离心5 min,吸除上清液,完成复苏。

复苏后加入培养基(DMEM +10%胎牛血清),移至25T 培养瓶中,放入37 ℃、5%的二氧化碳培养箱进行培养,于细胞铺满培养瓶90%～100%进行传代。加入PBS 缓冲液,洗去未黏着细胞,重复2～3 次,吸除PBS 溶液,加入0.25%的胰蛋白酶溶液进行消化,使用倒置显微镜对消化情况进行观察,细胞回缩变圆后,加入适量的培养基停止消化,制成细胞悬液。按1:2 进行传代培养。中间每2 d 更换一次培养基,每次传代重复以上操作,直至第4 代,如图2 所示,细胞密度增加且伸展状况良好,用于后续实验。

图2 第四代细胞培养情况

1.2.3 实验分组

对照组1 中未放置钛合金片,直接在24 孔板内接种细胞;对照组2 中既未放置钛合金也未接种细胞。实验组将钛合金薄片使用75%酒精进行清洗,高压蒸汽消毒晾干后,按精加工磨粒流磨粒粒径值的不同各取10 片,设置为实验组1(8 μm)、实验组2(10 μm)、实验组3(13 μm)和实验组4(18 μm),每片1 个孔。

1.2.4 细胞黏附

将细胞悬液加入培养液稀释至5 ml,血球计数板测得悬液密度8.4×105个/ml,取100 μl 悬液接种于24 孔板中的样品表面上(图3),细胞悬液能够借助液体自身的张力完全覆盖于钛合金片表面之上,置于细胞培养箱中培养。培养24 h 后,吸掉孔板中培养液,用PBS 洗去未黏附细胞,加入DMEM溶液与MTT 溶液,再培养4 h 后取出,吸除培养液,加入DMSO 溶液,于振荡器振荡至结晶完全溶解。每组各取部分溶液移至96 孔板,放入酶标仪中测量光吸收值(OD),并取平均。

图3 钛合金接种细胞悬浮液

MTT 比色法原理:对于外源性的MTT 溶液,活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将其还原为一种蓝紫色的甲瓒晶体。该晶体不溶于水,并且在细胞中沉积,而已经死亡的细胞无法完成该功能,故测定在490 nm 波长的条件下各组的光吸收值,吸光度越大,证明该组活细胞数目越多,反之亦然。

1.2.5 统计学分析

使用统计学软件SPSS 13.0 对细胞黏附实验得到的各组吸光度进行分析,由于从成骨细胞黏附实验获得的是重复测量数据,因此使用完全随机设计的单向方差分析方法。检验水准α=0.05,P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.2.6 黏附百分比

为了进一步表现各实验组以及对照组之间成骨细胞黏附效果的差异,使用细胞黏附百分比进行对比分析,如下式[12]所示。

式中,Pad为细胞黏附百分比,ODi为第i组实验的平均吸光度,OD对照1为对照组1 的MTT 实验吸光度平均值,OD对照2为对照组2 的MTT 实验吸光度平均值。

2 结果

2.1 钛合金表面粗糙度

使用8 μm 粒径磨粒流加工后薄片粗糙度Ra平均值与方差结果如表1 所示,由表可知,表面粗糙度Ra平均值范围为0.05～0.08 μm。同理,测量计算后得到10 μm 粒径的磨粒流加工得到钛合金片表面粗糙度Ra平均值范围为0.08～0.10 μm,13 μm粒径的磨粒流加工得到钛合金片表面粗糙度Ra平均值范围为0.10～0.12 μm,18 μm 粒径的磨粒流加工得到钛合金片表面粗糙度Ra平均值范围为0.12～0.15 μm。结果如表2 所示。

表1 8 μm 粒径磨粒流加工后薄片表面粗糙度Ra

表2 不同粒径加工结果

2.2 钛合金表面形貌

不同磨粒粒径磨粒流加工钛合金表面形貌观察结果如图4 所示。图4(a)为钛合金片经砂纸粗加工后的表面,密集分布有条纹状沟槽及凹坑,且沟槽的宽度与深度大小不一,整体表面精度低。图4(b)～(e)为进一步经过磨粒流精加工的钛合金薄片表面图,由图可见表面的沟槽结构已冲蚀消失,仅剩部分凹坑与挤出唇离散分布,且磨粒粒径越小,凹坑与挤出唇尺寸越小、数量越少。

图4 不同磨粒粒径磨粒流加工钛合金表面形貌

2.3 吸光度检测结果

用酶标仪检测各组黏附结果,并取平均值,实验组1～4 吸光度分别为0.098、0.127、0.122、0.118,对照组1 吸光度为0.144,对照组2 吸光度为0.006。由图5 可知,吸光度随表面粗糙度的增加呈现先增加再减小的趋势。

图5 各实验组吸光度与粗糙度对比图

统计学分析:实验组2、实验组3 和实验组4 三组吸光度两两之间无显著差异(P＞0.05),而对比实验组1,吸光度明显更高(P＜0.05)。另外,相较于各个实验组,对照组1 吸光度更高(P＜0.05)。

2.4 黏附比分析

图6为各实验组的细胞黏附百分比柱状图,从中得出黏附百分比最低的是实验组1,只有71.01%;实验组3 的细胞黏附百分比为88.41%,实验组4 为85.51%,两者实验结果相近;实验组2的细胞黏附百分比达到了92.02%,黏附率最高。

图6 钛合金细胞率柱形图

3 讨论

钛合金具备韧性好、强度高、密度低[13-14]等优良性质,其表面自然生成的TiO2氧化涂层能控制基体离子溶出,增强其抗腐蚀性与生物相容性。传统的抛光方式如车削、磨削,耗时长[15],并在材料表面形成一定规则的沟槽分布,且难以保证表面粗糙度的整体均匀性。本研究采用软性磨粒流约束流道的方法,利用磨粒在约束流道内的湍流壁面效应实现抛光加工,所用磨粒粒径范围为8～18 μm,加工得到的钛合金薄片表面粗糙度Ra整体范围在0.05～0.15 μm 之间,使用磨粒粒径越小,加工所得表面粗糙度Ra值越小。从图4 中观察可得,加工后的钛合金表面形貌未呈现出规律性,这是软性磨粒流加工无序性特征的结果,可能会对细胞在其表面的黏附、铺展起到较好的接触引导效果,同时表面的微坑与挤出唇增大了材料的表面积,可为细胞提供更多的黏附区域。

医用材料表面性质的变化对生物相容性的影响是人工关节领域的研究热点,表面性质中产生影响作用最大的就是微观几何和表面粗糙度[7]。已有研究表明,细胞中存在细胞黏附分子——整联蛋白,细胞外环境可通过其调控细胞内活性,蛋白的胞外结构域与其特异性的配体相互作用,可产生多种信号,对细胞黏附、生长、迁移等行为产生影响[16]。本研究采用体外实验的方法,观察在磨粒流处理后不同粗糙度Ra的钛合金薄片表面上MC3T3-E1 细胞的黏附差异。研究发现Ra于0.05～0.08 μm 内的薄片表面细胞黏附效果最差,说明过于光滑的表面,附着点少,不利于细胞黏附。对照组1 中,成骨细胞直接黏附于24 孔板的内壁上,吸光值明显高于钛合金实验组,说明钛合金薄片对成骨细胞的黏附存在抑制作用。此外,实验组2 薄片黏附率最高,为92%,因此认为磨粒流加工后得到Ra为0.08～0.10 μm的表面最有利于细胞黏附,而较粗糙和较光滑的表面均会在一定程度上影响成骨细胞的黏附效果。

目前,众多学者就表面粗糙度对细胞黏附的影响进行了研究。Deligianni 等人[17]利用3 种规格粗碳化硅砂纸处理钛合金表面,发现Ra为0.3 μm 表面细胞黏附量最少,粗糙度越高对细胞黏附行为越有利,与本研究结果差别较大。Huang 等人[18]利用抛光粉及砂纸处理出粗糙度Ra在50 nm～1.2 μm的5 种钛金属表面,结果显示金属表面的沟槽对细胞黏附有接触引导现象,且相对于较粗糙或较光滑的样品,Ra为150 nm 的表面表现出了最佳的细胞黏附性能,与本研究结果较为一致。

细胞黏附的影响因素众多,即使表面粗糙度Ra相同,材料不同或加工方法不同都会导致细胞反应的差异[19],因此,为探索不同加工方法的细胞黏附差异性,需就各自处理得到的最佳黏附表面的黏附效果进行对比分析。赵昕[20]对Ra为0.3 μm～1.8 μm的砂纸抛光后钛合金表面对MC3T3-E1 细胞黏附的影响机制进行了分析,发现粗糙度Ra介于0.9～1.0 μm 之间的表面得到了80%的最佳黏附率,相较之下,磨粒流加工后的最佳黏附率达到了92%,说明磨粒流技术加工出的表面形貌比砂纸抛光更适宜于MC3T3-E1 细胞黏附。

4 结论

本研究探索了磨粒流加工得到的Ti6Al4V 钛合金表面的微观形貌及表面粗糙度Ra对MC3T3-E1细胞黏附的影响,得到如下结论。

(1)通过观察磨粒流加工后的钛合金薄片表面形貌,发现其表面离散分布有微坑与挤出唇,均匀性较好,证实了磨粒流加工的优异性。

(2)通过对比对照组1 与钛合金实验组,发现实验组吸光值低,说明放置了钛合金后,反而对细胞的黏附起到了抑制作用。

(3)通过各个实验组之间的吸光值对比分析可得,粗糙度Ra为0.05～0.08 μm 实验组1 吸光值显著低于其他组,说明过于光滑的表面并不利于细胞黏附。

(4)从黏附率的计算结果来看,实验组2 黏附率最高,达到了92%,说明磨粒流处理后的钛合金表面最适宜细胞黏附的粗糙度Ra阈值为0.08～0.10 μm,这一结果为磨粒流加工技术及钛合金表面生物相容性的进一步研究提供了参考。