大孔树脂分离纯化嘉兰种子提取物中秋水仙碱的工艺研究*

刘建文，张宝蓉，庄燕琴,2，龚云麒，刘军锋

（1.昆药集团股份有限公司，云南 昆明 650100；2.云南省食品药品审核查验中心，云南 昆明 650100）

嘉兰（Gloriosa superba Linn.）为百合科（Liliaceae）嘉兰属植物，产于云南南部（西双版纳），生长于海拔950～1 250 m的林下或灌丛中，也分布于亚热带地区和非洲。据记载[1]其根状茎有剧毒，含有秋水仙碱。秋水仙碱（Colchicine）是一种生物碱，其作为高效抗痛风药，早期是预防家族性地中海热发作的首选药物[2]，现主要用于治疗关节炎、风湿痛、类风湿关节炎等疾病[3-5]。有研究[6-8]表明小剂量的秋水仙碱对于痛风性关节炎的治疗效果显著。小剂量秋水仙碱的临床疗效与大剂量给药相当且不良反应少，值得推广[9]。由于秋水仙碱能够抑制癌细胞的生长，因此，临床也用于癌症的治疗，特别是对乳腺癌有一定疗效[10]。

目前秋水仙碱多采用萃取法[11-13]进行纯化，萃取过程中使用了大量的二类溶剂，因此对环境保护和生产安全造成了巨大隐患。大孔树脂是一种有机高聚物吸附剂，是吸附性和筛选性相结合的多孔性高分子材料[14-15]。大孔树脂具有良好的稳定性和选择性，纯化效果显著[16-18]。由于大孔树脂操作方便，吸附量大，分离速度快，并具有可再生等优点，因此被广泛应用于中草药化学成分和高分子材料的分离和富集[19-21]。本研究以嘉兰种子提取物中的秋水仙碱为指标，筛选大孔树脂分离纯化秋水仙碱的工艺条件，旨在为秋水仙碱的纯化研究奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器R-3型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；DFY-1000D型1000 g高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；ZNHW20000ML型电热套（河南爱博科技公司）；SZCL-3B型数显智能控温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HWS-Z4型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；YY-TI-20L型超纯水制备系统（成都优越科技）。

1.2 试药与试剂嘉兰种子（批号：20190329）采集自云南南部西双版纳傣族自治州景洪市勐旺乡，经云南中医药大学杨竹雅副教授鉴定为百合科植物嘉兰（Gloriosa superba Linn.）的干燥种子；秋水仙碱对照品（批号：101176-202003）购自中国食品药品检定研究院；D001SD、AM007、ADS-8、ADS-5树脂（天津南开和成科技有限公司）；甲醇为色谱纯（德国默克公司）；乙醇为分析纯；磷酸二氢钾（四川西陇科学有限公司）；磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；实验用水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 秋水仙碱含量测定方法

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Thermo Acclaim 120C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水（32∶68）为流动相；检测波长为245 nm；流速为1 mL/min；柱温度为30℃；进样体积为20 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取秋水仙碱对照品适量置于棕色容量瓶中，用甲醇与水体积比为1∶1溶解并稀释配制成质量浓度为30 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超声（功率：100 W，频率：40 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2.2 大孔树脂纯化秋水仙碱的工艺研究

2.2.1 秋水仙碱提取液的制备 称量粉碎后并过三号筛的2 kg嘉兰种子，加入6倍体积的70%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽滤后合并滤液，浓缩至浸膏状，浸膏加水溶散（V药材投料量∶V水=1∶1），水沉3次，抽滤后合并滤液，即得秋水仙碱提取液。

2.2.2 大孔树脂型号的选择 取相同型号的玻璃柱，分别用5 mL的D001SD（强酸型）、AM007（离子型）、ADS-8（非极性）、ADS-5（非极性）湿树脂装柱，倒入相同批次、相同体积10 mL的上样液（质量浓度为3.00 mg/mL）。室温静置24 h，收集流出液进行HPLC检测。之后，向吸附后树脂中分别加入10 mL 95%乙醇解吸附，室温静置24 h，收集流出液进行HPLC检测。并通过下式对秋水仙碱吸附量及解吸量进行计算，结果见表1。

其中，C1为上样液浓度，C2为吸附后溶液浓度，V1为上样液体积，V2为树脂体积。

其中，C为解吸附溶液浓度，V1为解吸液体积，V2为树脂体积。

结果显示，ADS-8、ADS-5对秋水仙碱的吸附量均较高，但ADS-8的解吸附量高于ADS-5。综合可知，4种树脂材料中ADS-8树脂对秋水仙碱的吸附、解吸附效果较好，故选择ADS-8大孔树脂对嘉兰种子提取物中的秋水仙碱进行纯化。（见表1）

表1 纯化树脂型号选择

2.2.3 吸附流速的筛选 取10 mL的ADS-8树脂装柱，取上样液（质量浓度：2.25 mg/mL）100 mL上样，流速分别为1、2、3、4 BV/h，接收流出液，每10 mL为一流分，检测流出液中秋水仙碱含量，并记录泄漏流分号。结果显示，以1、2 BV/h的吸附速度上样，接收流出液100 mL（1 BV）时，秋水仙碱吸附量分别为2.20、2.21 mg/mL；以3、4 BV/h的吸附速度上样，接收流出液80 mL（0.8 BV）时，秋水仙碱吸附量逐渐降低。且吸附流速＞2 BV/h时，随着吸附速度的加快，吸附量逐渐降低。在考虑到效率的情况下，选择以2 BV/h为最适吸附流速。（见表2）

表2 ADS-8树脂吸附流速筛选结果

2.2.4 洗脱溶剂的筛选 大孔树脂拟采用乙醇-水混合溶剂洗脱，相同上样条件下分别用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇洗脱4 BV，洗脱流速为2 BV/h收集洗脱液，测定溶液中秋水仙碱含量及纯度。结果可知，当以水、10%乙醇作为洗脱溶剂时，洗脱液中未检出秋水仙碱，无法洗脱目标物；增加乙醇浓度可以将树脂上的秋水仙碱洗脱，40%乙醇洗脱液中秋水仙碱的含量和纯度均较高；但随着乙醇浓度的增加，洗脱液中其他杂质也被洗脱，导致秋水仙碱纯度降低，不利于其分离纯化，因此，考虑用水、10%乙醇洗脱去除部分色素及杂质，然后将乙醇洗脱液的浓度控制在40%左右，并做进一步的观察。（见表3）

表3 一次纯化洗脱溶剂选择

2.2.5 水和10%乙醇洗脱倍数的筛选 取上样液（质量浓度：2.25 mg/mL）43 mL（相当于原药材10 g）上样至分离柱，分离材料ADS-8树脂40 mL，用水洗脱4 BV，再用10%乙醇洗脱4 BV，洗脱流速为80 mL/h（即2 BV/h），按体积计量收集水和10%乙醇洗脱液，每次接收40 mL。将每个体积的收集液用标准比色液比色，记录现象后检测其秋水仙碱含量。结果可知，水洗脱2 BV后，溶液为黄色调7色级且不再变化，10%乙醇洗脱3 BV后溶液为黄色调4色级且不再变化，经检测，水和10%乙醇洗脱液均不含秋水仙碱，为节约成本，选定先用水洗脱2 BV，再用10%乙醇洗脱3 BV，将部分色素及溶于水的杂质除去。（见表4～5）

表4 水洗倍数选择

表5 10%乙醇洗脱倍数选择

2.2.6 35%～45%乙醇-水溶液洗脱情况 取相同条件的ADS-8层析柱（ADS-8体积40 mL），分别吸附等体积（43 mL）上样液（质量浓度：2.25 mg/mL）。层析柱分别以35%、40%、45%乙醇溶液洗脱，洗脱流速为80 mL/h。收集洗脱流出液，每40 mL（1 BV）为一流分，分别测定各流分的秋水仙碱峰面积及固形物质量。根据所得秋水仙碱及固形物质量绘制洗脱曲线。结果可知，10 BV的35%乙醇溶液、40%乙醇溶液、45%乙醇溶液对有效成分秋水仙碱的解析率（洗脱量/上样量）分别约为90.41%、99.01%、99.54%。从生产成本和节约使用溶剂出发，考虑到使用40%、45%乙醇溶液时秋水仙碱的高转移率差别不大，确定用40%乙醇溶液进行秋水仙碱的洗脱。（见图1～3、表6）

图1 35%乙醇-水溶液洗脱曲线

图2 40%乙醇-水溶液洗脱曲线

图3 45%乙醇-水溶液洗脱曲线

表6 不同浓度洗脱液对秋水仙碱的解析率

2.2.7 40%浓度乙醇洗脱倍数筛选 取处理好的200 mL的ADS-8树脂装柱，上样（质量浓度：2.25 mg/mL）215 mL提取液（相当于50 g药材），用水洗脱2 BV和10%乙醇洗脱3 BV后，再以40%乙醇洗脱，洗脱流速为400 mL/h（即2 BV/h）。以200 mL为单位收集40%乙醇洗脱液，按照体积逐倍进行接收，分别用HPLC测定1～8 BV。结果可知，40%乙醇洗脱至第8 BV时，秋水仙碱的含量和转移率都较低，且纯度基本维持在27%～29%。为了尽可能收集秋水仙碱，以减少其损失，综合考虑，以40%乙醇洗脱8 BV，并收集40%乙醇洗脱液，其效果较好。（见表7）

表7 40%乙醇洗脱倍数确定

2.2.8 洗脱流速的筛选 取处理好的100 mL的ADS-8树脂装柱，上样液（质量浓度：2.25 mg/mL）108 mL（相当于25 g药材），以2 BV/h流速上样，用水洗脱2 BV和10%乙醇洗脱3 BV后，再用40%乙醇洗脱8 BV，洗脱流速分别为2、3、4 BV/h，收集洗脱液。每1 BV为一个流分，检测其中秋水仙碱的含量及洗脱液干质量，绘制洗脱曲线。结果可知，8 BV的40%乙醇溶液以2、3、4 BV/h洗脱流速对有效成分秋水仙碱的解吸率（洗脱量/上样量）分别为97.56%、91.30%、87.51%。以2 BV/h的洗脱流速对秋水仙碱的洗脱效果较好，故确定用2 BV/h的洗脱流速进行洗脱。（见图4～6、表8）

图4 洗脱流速2 BV/h洗脱曲线

图5 洗脱流速3 BV/h洗脱曲线

图6 洗脱流速4 BV/h洗脱曲线

表8 洗脱流速的筛选结果

2.2.9 验证试验 称量粉碎后并过三号筛的2 kg嘉兰种子，用6倍体积的70%乙醇，回流提取3次，每次2 h。浓缩至流浸膏加水溶散（V药材投料量∶V水=1∶1），水沉3次，过滤后收集滤液。取3根相同规格的玻璃层析柱，装入处理过的ADS-8树脂各2 L，秋水仙碱上样液（质量浓度：2.00 mg/mL）1.5 L（相当于500 g药材）以2 BV/h的流速分别上样，以2 BV/h的流速用水洗脱2 BV和10%乙醇洗脱3 BV后，再用40%乙醇洗脱8 BV，收集40%乙醇洗脱液，测定其中秋水仙碱的含量并计算转移率。结果可知，按照该工艺实施可将嘉兰种子提取液中的秋水仙碱的转移率保持在64%左右，其纯度也提高了约8.0倍。（见表9）

表9 ADS-8树脂工艺验证结果

3 讨 论

本研究建立了嘉兰种子提取物中秋水仙碱的纯化工艺，通过比较不同大孔树脂对嘉兰种子提取物中秋水仙碱的纯化效果，以吸附量、解吸附量、转移率、纯度和含量等考察指标，最终确定的秋水仙碱的纯化工艺为：吸附流速为2 BV/h；以水洗脱2 BV和10%乙醇洗脱3 BV后，再以40%乙醇溶液洗脱8 BV，收集40%乙醇洗脱流出液；洗脱流速为2 BV/h。

经过工艺验证，ADS-8型大孔树脂对嘉兰种子提取物中秋水仙碱的分离纯化效果较好，多次试验确定了工艺具有较好的稳定性和重复性。其适用于工业大规模生产，也为临床研究进一步提供了工作基础和技术支持。