基于粒径和形貌视角下探究微乳剂是否为纳米农药

程敬丽， 梁文龙， 张家栋， 熊秋雨， 赵金浩

(浙江大学农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室 浙江省作物病虫生物学重点实验室，浙江 杭州 310058)

当今全球人口迅速增长，预计到2050年将达到90亿以上[1]，粮食安全生产是全球面临的关键挑战，大量的农用化学品尤其是农药的使用，可有效降低病、虫、草害的胁迫，能够每年提高全球粮食产量超过30%[2]，但是常规农药制剂喷施后会由于界面张力[3]而引起弹跳滑落[4]或聚并流失[5]，不仅导致现有农药利用率低、持效期短，而且脱靶的农药进入到环境中不断富集，造成农业生态系统和土壤的衰退，并对生态及农产品安全带来风险[6]，最终影响人类的健康与农业的可持续发展[7]，因此，亟需发展农药制剂新技术来解决这些问题。

优化农药制剂及其递送系统是提高农药利用率和安全性的有效途径[8-9]。近年来，纳米尺度(1～100 nm)的材料因其具有高的穿透性、渗透性和比表面积等特性[10]，已经在化学、材料、医学、能源和生命科学等领域得到了广泛应用，并逐渐在农业领域中形成了一个新兴的交叉学科[11]。2019年国际纯粹与应用化学联合会首次把纳米农药列为全球可持续性发展的十大化学新兴技术之首[12]。但对于纳米农药的定义，各个国家和国际组织尚未统一。目前普遍使用粒径尺寸去定义纳米农药，如Kah等[13]基于颗粒粒径广义地将小于1 000 nm，或具有与小尺寸相关新特性的，或以“纳米”为前缀的农药剂型定义为纳米农药。在我国农药传统剂型中，微乳剂粒径一般在10～100 nm[14]，外观为透明状态，其粒径远低于一般乳状液(如水乳剂)，而与纳米农药比较接近，有些产品就打着纳米农药的概念来推广，也有报道把微乳剂列入纳米农药中[15]。

纳米农药的定义首先是从粒径尺寸来判断的，此外还具有一些更好的生物活性，比如黄啟良等[16-17]使用纳米二氧化硅对农药进行负载，能够提高农药在作物上的吸收与输导，有些还提高了农药在菌丝中的穿透性，负载后形成的纳米农药平均粒径均在200～300 nm。赵金浩等[18-19]通过使用金属有机框架材料ZIF-8负载咪鲜胺或吡唑醚菌酯后，能提高杀菌剂被油菜吸收与传导的能力，制备的纳米农药平均粒径均在150 nm左右。赵金浩等[20]采用“纳米笼”方法制备的纳米噻唑锌，粒径只有35 nm左右，提高噻唑锌的药效达10%以上；徐汉虹等[21]通过高分子纳米材料负载典型非内吸性农药阿维菌素后，粒径只有60 nm左右，除了显著增加生物活性，还能够通过作物叶片吸收后在体内输导，而商品化的阿维菌素微乳剂即使达到了纳米尺寸100 nm左右，但并未有报道其具有内吸传导性。距今为止，多数报道的纳米农药平均粒径均在1～300 nm。测试方法除了基于动态光散射(DLS)的激光粒度测定法，还会结合电镜技术(SEM或TEM)来综合判断。

因此，本课题组在前期制备纳米噻唑锌、纳米咪鲜胺(PD@ZIF-8)、纳米吡唑醚菌酯(Pyr@ZIF-8)的研究基础和技术手段上，对市场上能采购到的几种商品化微乳剂，从颗粒粒径的角度，采用DLS纳米粒度测定仪和扫描电镜对微乳剂的微观粒径和形貌进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料

商品化微乳剂(为避免引起歧义与纠纷，特隐去生产厂家的名称)：4.5%高效氯氰菊酯·甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂(微乳剂1，ME-1)、5%高效氯氟氰菊酯微乳剂(ME-2)、5%胺·氯菊杀虫微乳剂(ME-3)、5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微乳剂(ME-4)和0.1%三十烷醇微乳剂(ME-5)。

ZIF-8纳米农药：本实验制备以ZIF-8作为载体的纳米咪鲜胺(PD@ZIF-8)作为对照样品，详细制备方法及结构表征见文献报道[18]。

1.2 实验仪器

Zetasizer Nano S90激光粒度分析仪(英国马尔文公司)；JSM5600LV扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；Zeiss，G300场发射扫描电子显微镜(德国卡尔蔡司股份公司)。

1.3 方法

1.3.1 微乳剂粒径测定

不同商品化微乳剂的粒径分布通过ZS-90马尔文激光粒度仪进行测定。该仪器以633 nm激光作为光源，扫描角度为90°，测定范围为0.3 nm～5 μm。样品测定前用水分别稀释为有效成分含量为10 000、1 000和100 μg·mL-1的溶液。

1.3.2 微乳剂颗粒形貌观察

分别用水将不同商品化微乳剂稀释成有效成分含量为100 μg·mL-1的溶液，滴加到导电硅片上，待干燥后进行喷金处理。采用热场发射扫描电子显微镜(蔡司G300)对干燥后微乳剂的颗粒形貌进行观察。

2 结果与讨论

2.1 微乳剂的粒径及其分布

在喷施农药时，一般须将商品化农药制剂加水稀释到一个对作物安全的浓度，方能施用。因此，为探究农药颗粒在被稀释过程中粒径是否发生改变，使用马尔文激光粒度测定仪对5种不同的商品化微乳剂，分别用水稀释成有效浓度含量为100、1 000、10 000 μg·mL-1后，进行粒径测定，同时以本实验室合成的ZIF纳米农药(PD@ZIF-8)作为对照样品。首先得到各药剂不同浓度下的粒径分布图(图1)。微乳剂5种产品不同浓度下的粒径分布并不统一，差异较大，而对照药剂ZIF-8纳米农药不同浓度下的粒径分布差异不大，比较统一，平均粒径都在250～300 nm，变化不大。

图1 不同稀释浓度下商品化微乳剂的粒径分布图(以ZIF纳米农药为对照)

基于DLS测定粒径，可以得到平均粒径、多分散指数、累计粒度分布百分数为50%的粒径(D50)和累计粒度分布百分数为90%的粒径(D90)等主要统计数据，其中多分散指数，即相对偏差，是指示分散度的一个重要指标。各种药剂的具体粒径数据见表1，可以看出，微乳剂1、微乳剂2和微乳剂3在不同稀释倍数下，平均粒径差异不大，均处于100 nm范围内，然而D90时，微乳剂1和微乳剂3最大粒径分别可达到2 320和3 730 nm。而微乳剂4和微乳剂5在不同稀释倍数下均呈现出更宽的粒径变化趋势，平均粒径最大可达868.6和851.0 nm，此外D90最大粒径分别可达到2 850和5 350 nm，这说明微乳剂中农药胶束的形成处于动态平衡中，在稀释过程中粒径会随不同稀释程度发生无规律性变化，且可能会出现破乳后药物大颗粒析晶的现象，最终造成粒径不均一，并不都处于以粒径定义的纳米农药范畴内。反之，通过对比测定同等药物含量的ZIF纳米农药(PD@ZIF-8)，可发现平均粒径都在250～300 nm，变化不大，D50和D90均无显著的变化。表明液态化的微乳剂在不同浓度条件下，粒径分布会动态宽幅变化，而负载化的纳米农药以固体颗粒形式存在，不同浓度稀释不会改变颗粒的粒径大小。

表1 不同稀释浓度下商品化微乳剂的粒径参数

2.2 微乳剂电镜下的微观形貌

农药喷施后，短期以液滴形式附着于作物表面，随着水分蒸发，在叶面逐渐干燥，最后微观下还是以固体状态存在，因此，通过扫描电镜探究同等药物含量的商品化微乳剂与ZIF纳米农药液滴干燥后的颗粒形貌与大小。如图2所示，商品化微乳剂液滴干燥后尽管依然存在少量以纳米尺寸存在的药物晶体颗粒，但是可观察到大量的药物颗粒分布很不均匀，有颗粒聚集现象，有的颗粒高达微米级，药物的分布不均和结块造成局部接触浓度过高，这可能也是影响农药有效利用率与作物产生药害的主要原因之一。ZIF纳米农药(PD@ZIF-8)液滴干燥后，仍然可观察到单分散的纳米颗粒，平均粒径在129 nm左右[18]，颗粒与颗粒之间相对独立，除了因小颗粒之间的弱相互作用力造成的吸附作用外，没有明显的结块现象。微乳剂没有呈现出纳米颗粒所具有的更高的持效性、缓释能力与作物的吸收转运能力等优点，可能与微观下颗粒不均，发生聚集、结块，导致作物吸收转运不够有关系。

微乳剂分散在水中后有效成分粒径较小，呈现透明状态，主要是借助表面活性剂的增溶作用将液体或固体原药均匀分散在水中形成的一种水包油型(O/W)胶束，表面活性剂的用量一般为活性物质的两倍以上，并且需要一定量的有机溶剂和增溶剂。表面活性剂和溶剂的选择非常关键，否则极易发生结晶和转相。鉴于微乳剂中农药胶束的粒径与形成机制，胶束应归类为两亲性胶体，而不应该是固体纳米颗粒，因为组成胶束的单分子或单聚体处于动态平衡中，在特定的场景下，农药胶束的形态与粒径可能会发生改变，如胶束溶液浓度的改变或者干燥[22]。这与表1不同浓度稀释下粒径差异比较大和干燥后电镜下微观形貌(图2)中的结果也比较吻合。纳米农药从其科学本身属性来说，其最主要的技术指标为纳米尺度，纳米制剂要发挥其纳米尺度效应，必须保证其喷施到靶标作物叶面或者直接使用时为纳米尺度[13]，仅仅制剂分散形态为纳米尺度是不够的，就像微乳剂，必须兑水稀释施用，稀释的过程会改变制剂的分散状态带来新的分散，不一定能保证在叶面上是纳米级别的单分散状态。

图2 不同商品化微乳剂与ZIF纳米农药的扫描电镜

3 小结

本研究基于DLS测试粒径基础上首次结合SEM技术，从粒径大小和微观形貌特征视角下，对市场上常见的几种商品化微乳剂进行了详细的测试分析，并与本课题组前期制备的ZIF纳米农药进行对比，发现几种商品化微乳剂在稀释过程中粒径均无规律改变，尤其在扫描电镜下观察含药液滴干燥后颗粒分布不均，有聚集、大颗粒析出现象，而纳米农药经过不同浓度稀释后粒径变化不大，均在1～300 nm，并且在扫描电镜下观察微观形貌也是单分散纳米状态，不会聚集，这表明在实际应用场景中均以纳米尺度分散状态稳定存在。因此，单靠动态光散射测定的粒径不能判断微乳剂就是纳米农药，还需要参考电镜技术观察微观下的分散状态和粒径变化情况，本研究为我国纳米农药的发展提供了分析鉴定技术方法，也为我国纳米农药的标准制定提供了数据支撑。