独脚金内酯(GR24)对微藻-真菌净化水产养殖废水效果的影响

弓忠孝

(呼和浩特市土默特左旗哈素海服务中心，内蒙古 呼和浩特 010100)

随着生活水平的提高，我国人民对水产品的需求量正逐年增大，这也促进了我国水产养殖业的发展。据统计，2018年我国水产养殖总量超过5 000万t，占水产品总量的78%以上[1]。为保证养殖水的质量，在水产养殖过程中需定期且频繁地进行换水处理，其结果是造成大量含氮、磷、有机物废水的外排。而养殖废水未经妥善处理即排放则会引发系列环境污染问题，导致病害滋生并成为制约水产养殖业进一步发展的限速环节。

微藻作为一种光自养型生物具有环境适应性强、生长速度快、生长周期短、能有效降解有机物、固定水体氮磷等诸多优点[2]。而水产养殖废水中所富含的营养物质(含碳有机物、氮和磷)可为微藻的生长提供廉价营养原料。如Ansari等[3]利用3种微藻开展了对尼罗罗非鱼养殖废水的处理研究，发现养殖废水中总氮(TN)、总磷(TP)和化学需氧量(COD)去除率可分别达到76%～81%、100%和42%～69%。吕俊平等[4]研究也发现，绿球藻能够去除水产养殖废水中96.92%的COD、98.08%的氨氮及98.36%的TP。值得一提的是，与传统处理方法相比，利用微藻实现对废水的净化处理具有效率高、能耗低、无化学添加等诸多突出优势[5]。此外，在实现废水生物净化的同时，还能实现微藻自身生物量的增殖，增殖的微藻通过深加工工艺还可转化为生物燃料、化工原材料及动物饵料等[6]。

真菌对废水中的大多数有机污染物同样具有较好的降解能力，因而可与微藻结合形成具有多种功能的微藻-真菌共生体系并应用于废水处理领域。而这一目标之所以能实现是源于微藻-真菌能建立互利关系，即微藻通过光合作用有效固定真菌分解代谢过程中所产生的CO2及水中以碳酸盐、重碳酸盐形式存在的CO2，并将其转化为真菌可利用的物质如氨基酸、碳水化合物、脂肪及其他营养素形式的碳源[7]；同时真菌可分泌微藻快速生长所需的维生素、吲哚-3-乙酸等生长激素[8]。现有研究结果也证实了细菌、真菌介入后所形成的藻-菌共生体系对废水处理有积极作用。如黄静依等[9]研究发现，选用小球藻、隐藻分别构建菌-藻共生系统，均表现出比纯藻系统更高的生物量及对水产养殖废水中氮磷更高的去除率。此外，在微藻-真菌共生体系中，真菌的存在能辅助微藻进行生物絮凝，并通过胞外多糖黏附、静电中和及微藻与真菌菌丝表面蛋白质相互作用，成功地形成藻-菌球，从而解决单一微藻处理废水过程中微藻无法有效分离和回收的问题[10]。

提取于植物根系分泌物的独脚金内酯最初作为一种重要的激素类物质，可用于调控植物的生理代谢过程及促进植物的生长[11]。现有深入研究发现，独脚金内酯的诱导还能刺激真菌线粒体代谢及促进丛枝菌根真菌的分枝、繁殖[12]。而作为一种人工合成的独脚金内酯(GR24)，GR24被认为可参与藻类细胞的生化反应。如研究发现，当体系中添加适量的GR24后，小球藻的相关生长、光合性能参数指标均得到增强，从而增强共培养体系对废水中营养物质的去除性能[13]。此外，在藻-菌共生体系中添加GR24能有助于体系中形成稳定且大小均一的藻-菌球[14]。

利用藻类技术处理水产养殖废水既具有生态效益又有一定的经济效益，但提高水产养殖废水中污染物质的去除效率是藻类技术应用于水产养殖废水净化处理的关键。目前已有大量对藻类技术进行改进的相关研究报道，诸如涉及到藻种的选择、光照培养条件的优化、微藻-真菌共生体系的优化等。目前，外源添加GR24，同时利用微藻或微藻-真菌共生体系处理水产养殖废水的研究在国内还鲜见报道。为此，本研究采用两种藻类处理技术(小球藻单养、小球藻-灵芝菌共生)净化处理水产养殖废水。研究过程中通过改变外源GR24的添加量，关注GR24浓度变化对两个处理体系中微藻/藻-菌共生体生长性能、光合性能、对水产养殖废水中营养物质的去除性能的影响，并根据废水净化效果优选出最佳的藻处理技术及GR24的最佳外源添加量。研究结论能为藻类技术在水产养殖废水净化处理领域的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

实验涉及的仪器包括：TG-17型高速冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；BKQ-B50II型全自动数显立式压力蒸汽灭菌器，山东博科消毒设备有限公司；HT-12X2C型摇床，上海赫田科学仪器有限公司；202-2AB型卧式电热恒温鼓风干燥箱，广东佛衡仪器有限公司；YJ-VS-1型超净工作台，无锡一净净化设备有限公司；UV5型紫外分光光度计，梅特勒-托利仪器(上海)有限公司；MS204/A型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；QL-866型旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

实验所用材料和试剂包括：葡萄糖、丙酮、无水乙醇、浓盐酸、浓硫酸、冰乙酸、氢氧化钠、二水合磷酸二氢钠、重铬酸钾、抗坏血酸、二水合氯化钙、硫酸亚铁铵、七水合硫酸镁、钼酸铵溶液、三水合磷酸氢二钾、过硫酸钾、尿素均购置于上海国药集团化学试剂有限公司。实验所使用的GR24(CAS No：76974-79-3)购于上海懋康生物科技有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 藻种和真菌

小球藻Chlorellavulgaris(FACHB-8)购自中国科学院武汉水生生物研究所；灵芝菌Ganodermalucidum(5.765)从中国普通微生物菌种保藏管理中心获取，并根据相关文献制备小球藻和灵芝菌培养基，小球藻和灵芝菌的培养与扩培参照相关文献进行[15]。

将扩培的灵芝菌球悬浮液(84.29 mg·L-1)5 mL加入到100 mL小球藻悬液(76.28 mg·L-1)中，使小球藻与灵芝菌共培养体系初始浓度约为89.63 mg·L-1。利用10%的水产养殖废水将小球藻-灵芝菌混合体系于恒温摇床上(25±2)℃ 150 r·min-1驯化培养7 d。驯化后的小球藻-真菌颗粒将用于后续水产养殖废水的净化处理。

1.3 两种藻类处理技术体系的构建

实验所使用的GR24使用前用二甲基亚砜(纯度>99%)溶解后用水稀释配制成一定浓度的溶液，稀释法遵循Wang等[16]的研究方法。

处理体系1中小球藻-灵芝菌共培养液为1 L，最初的藻类和灵芝菌的生物量比为1∶10，其总悬浮固体浓度为0.82 g·L-1。处理体系2为小球藻单养。

1.4 光生物反应器

光生物反应器为1个16.8 L的玻璃罐(图1)。实验处理前，预先向反应器(带LED灯管)中注入2.8 L水产养殖废水，随后分别采用两种不同处理体系分别对该水产养殖废水进行处理。水产养殖废水净化处理光照强度为200 μmol·m-2·s-1，光暗比为12 h:12 h，反应温度为(25±2)℃。

图1 光生物反应器结构

1.5 水产养殖废水水质特征

实验所用水产养殖废水取自内蒙古呼和浩特市某水产养殖企业，并于4 ℃条件下储存备用。净化处理前为避免原有水产养殖废水中微生物的影响，预先使用0.45 μm尼龙微滤器过滤并进行灭菌处理，经处理后其COD含量为49.61 mg·L-1、TN含量为26.58 mg·L-1、TP含量为2.75 mg·L-1、pH 7.5±0.1。

1.6 处理设计

利用光生物反应器，采用两种不同的藻类体系分别对水产养殖废水开展净化处理。处理时，光生物反应器中两个处理体系中初始生物量均为89.63 mg·L-1。在水产养殖废水净化处理前向各处理体系中添加GR24，共设置4个浓度水平(0、10-7、10-9和10-11mol·L-1)。光照反应器运行处理10 d，实验期间在水产养殖废水净化处理的第3、7和10 天分别从反应器采样口采集样品并开展相关指标的分析检测，以评判两种藻类技术对水产养殖废水净化处理的效果，从而最终确定最佳藻类处理技术和GR24添加量。

1.7 分析方法及数据处理

参照文献[17]分析方法，在处理的第3、7和10天分别测定两种藻类处理技术体系中小球藻叶绿素a(CHL-a)含量。水产养殖废水净化处理的第10天，从光生物反应器吸取50 mL处理液，参照Zhang[18]的方法测定生物质的比生长率和平均日产率。实验处理的第10天，从光生物反应器取样口取2 mL不同处理体系的混合液，置黑暗处适应25 min后利用Aquapen手持式叶绿素荧光测量仪测定叶绿素荧光变化(OJIP open-JIP test)，并通过OJIP测定获得相关荧光参数指标，用以评价不同处理体系中小球藻的光合活性。实验处理的第3、7和10 天从光生物反应器对不同体系处理后的水产养殖废水进行取样。参照相关分析方法，对采集废水样品进行预处理及COD、TN和TP的分析测定[19]。

每组实验处理均设3个重复，所有实验数据结果均为数据平均值，数据统计分析采用SPSS 19.0软件。采用Duncan’s多重比较法检验不同处理体系中GR24浓度变化对藻菌生长、光合参数和对水产养殖废水净化效果影响的显著差异性。

2 结果与分析

2.1 GR24浓度对生物量的影响

利用微藻或微藻-灵芝菌共生技术处理水产养殖废水，其处理效果在很大程度上受限于体系中微藻或微藻-灵芝菌共生体的比生长率，比生长率高代表着体系中微藻或微藻-灵芝菌共生体的繁殖速率越快，也就意味着对水产养殖废水的净化效果越好。在GR24设置的4个浓度水平(0、10-7、10-9和10-11mol·L-1)条件下，利用不同藻类处理体系对水产养殖废水进行净化处理，不同处理体系中微藻或微藻-灵芝菌共生体的比生长速率和平均日产率结果见表1。

表1 GR24浓度对净化水产养殖废水的影响

由表1数据可以看出，两个处理体系中的小球藻均能正常存活。统计结果表明，GR24添加量的变化对两个处理体系中的小球藻的生长均会产生显著的影响。与空白对照组(不添加GR24)相比，处理体系中添加GR24(≥10-9mol·L-1)均显著促进了小球藻的生长。随着GR24浓度的增加，两个处理体系中小球藻的比生长率和平均日产率均呈现先增大后降低的变化趋势，当GR24在体系中的初始浓度为10-9mol·L-1时生长效果最佳，此时，小球藻的比生长率分别为0.398(处理体系1)和0.341 d-1(处理体系2)；小球藻的平均日产率为0.189(处理体系1)和0.156 g·L-1·d-1(处理体系2)。

2.2 GR24浓度对微藻光合性能的影响

光合作用是藻类重要的生理活动过程，而CHL-a则在光合过程中发挥重要作用，因此，CHL-a是评价微藻生长的重要间接指标。GR24浓度变化对两种藻类技术处理体系中小球藻CHL-a浓度变化的影响结果如图2所示。在水产养殖废水净化处理的第3、7和10 天，处理体系1中的小球藻CHL-a含量相对高于处理体系2。在不同GR24浓度条件下，两个处理体系中小球藻CHL-a含量均在处理的第7 天达到最大值。处理第7 天，在处理体系1和处理体系2中，当GR24的浓度为10-9mol·L-1时小球藻CHL-a的含量最高，分别为226.84和189.69 μg·L-1。

同组柱上无相同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)，图3同。

叶绿素a荧光瞬变技术(OJIP)是研究植物光合作用或外界胁迫作用时常采用的方法。当生长环境出现变化时微藻的光合活性等参数也会随之发生响应变化，这时也可以用OJIP技术进行测试和表征。通过OJIP曲线可获得相关光合参数如Fv/Fm、PIABS、ΨO、ΦEO等，其中Fv代表最大可变荧光；Fm代表OJIP峰值P处记录的最大荧光强度；Fv/Fm代表了PSⅡ最大量子效率，该参数反映了PSⅡ反应中心内光能转换效率；PIABS表征PSⅡ吸收光子的性能指数；ΨO代表了推动QA还原激子的比率；ΦEO代表了和用于电子传递的量子产量[20]。

不同GR24浓度条件下，利用两种藻类处理技术对水产养殖废水处理10 d后对小球藻的OJIP曲线进行了测试(表2)。从表2数据可以看出，随着GR24浓度的增加，两个处理体系中Fv/Fm、PIABS呈现先升高后降低的变化趋势。当体系中GR24浓度为10-9mol·L-1时，各处理体系中Fv/Fm、PIABS值均显著高于其他GR24浓度添加水平。这说明处理体系中添加适量的GR24(10-9mol·L-1)对处理体系中微藻PSⅡ的光促反应有一定的促进作用。ΨO、ΦEO可用于评判GR24浓度变化对藻类-真菌共生体的影响。从表2数据可以看出ΨO、ΦEO随GR24浓度的变化趋势与Fv/Fm和PIABS值的变化一致。说明处理体系中适量添加GR24可以促进微藻对光的吸收而提高电子转移效率和强化最大电子转移产率。

表2 处理第10 天净化水产养殖废水的光合性能参数变化

2.3 GR24浓度对水产养殖废水中营养物质去除效果的影响

整个实验阶段在不同GR24浓度下，两种藻类处理技术对水产养殖废水的净化效果见表3。处理体系1净化处理水产养殖废水第3、7和10 天，废水中COD、TN和TP去除效率随GR24浓度变化的结果见图3。

从表3数据可以看出，当处理体系中GR24浓度发生变化时，不同处理体系对COD的去除效率存在差异。与空白对照组(不添加GR24)相比，当GR24的浓度为10-9～10-7mol·L-1时GR24对该水产养殖废水COD的去除具有促进作用，这说明适量添加GR24能诱导小球藻同化更多废水中的含碳营养物质，这一结果与小球藻的生长速率和平均日生产率变化规律相一致(表1)。当GR24的浓度为10-9mol·L-1时COD的平均去除效果最佳，分别为92.5%(处理体系1)和87.9%(处理体系2)。从图3可以看出，从第3 天到第7天在处理体系1(小球藻-灵芝菌)中COD的去除率增大，然后从第7 天到第10 天COD的去除率下降。在处理的第7 天，当GR24浓度为10-9～10-7mol·L-1时COD去除效果最佳(93.7%～96.3%)。

表3 不同GR24浓度下水产养殖废水中COD、TN和TP去除效率

图3 不同GR24浓度下处理体系1COD、TN和TP的去除率

与空白对照组(不添加GR24)相比，当GR24的浓度为10-9～10-7mol·L-1时GR24对沼液TN的去除存在明显促进作用(表3)。当GR24的浓度为10-9mol·L-1时TN的平均去除效果最佳，分别为94.9%(处理体系1)和90.6%(处理体系2)。在处理体系1中TN去除率随时间的变化趋势与COD去除率的变化趋势相一致。在处理的第7 天，当GR24浓度为10-9mol·L-1时TN去除效果最佳(98.3%)。

TP的去除是衡量藻类技术营养盐去除效率的重要指标之一。从表3可以看出，当GR24的浓度为10-9mol·L-1时TP的平均去除效果最佳，分别为97.1%(处理体系1)和92.8%(处理体系2)，依然表现为处理体系1>处理体系2。在处理体系1中TP去除率随时间的变化仍表现为先升高后降低的变化趋势，类似于COD和TN去除率的变化。在处理的第7 天，当GR24浓度为10-9～10-7mol·L-1时TP去除效果最佳(96.5%～98.1%)。

以上分析结果表明，在不同GR24浓度下，借助不同的处理体系，水产养殖废水中各营养物质的去除效率存在差异。其中，利用小球藻-灵芝菌的共生体系(处理体系1)，在GR24浓度为10-9mol·L-1时废水中各营养物质的去除效率表现最佳，说明GR24的外源添加量具有最适值。

3 小结与讨论

Song等[21]研究认为，独脚金内酯的存在对微藻的生长不会产生明显的促进作用，这与本研究结论不一致。这可能是因为实验中用到的独脚金内酯成分、选择的藻种、藻菌共生体系、光照处理条件、处理对象存在差异。Zhang等[13]的研究也发现，当外源添加GR24浓度为10-9mol·L-1时，藻-菌共生体系中微藻的生长状态处于较好水平。这与本实验的研究结论相一致。相关研究认为，这主要是源于体系中存在适量的GR24(10-9～10-7mol·L-1)能通过调控相关基因来促进微藻细胞的生长[22]。两种藻类处理技术相较而言，小球藻的比生长率和平均日产率均表现为处理体系1>处理体系2。

在两种藻类技术处理体系中，外源添加GR24的最佳浓度为10-9mol·L-1。这与前人的研究结果相一致[23]。这说明适量添加GR24对体系中小球藻的生长有促进作用，从而促进CHL-a含量的增加。这可能是因为外源添加的GR24能促进共生体系中微藻叶绿素合成基因表达的增强[13]。此外，有研究发现培养体系中添加GR24能促进真菌菌丝的生长，从而能进一步增加藻类生物间的接触频率，促进微藻-真菌球的形成[24]。OJIP的分析结果与CHL-a的含量变化结果(图2)相一致，这也间接说明了CHL-a在光合作用过程中所发挥的重要作用[25]。相较而言，在不同GR24浓度添加水平条件下，不同处理体系中小球藻相关光合参数值的高低顺序均表现为处理体系1>处理体系2。

微藻细胞中的基本元素碳约占其生物总量的50%，而碳同化作用是利用微藻技术去除水体中碳的主要机制[26]。除了对水体中碳源的利用，微藻在光合作用过程中还能将废水中的氮和磷等营养物质合成复杂的有机物，实现对水体氮、磷的去除。其中氮的去除主要是源于微藻在繁殖过程中需要利用氮来合成大量的核酸和蛋白质类组分[27]。陈海敏等[28]利用小球藻单养和小球藻+光合细菌联合技术处理甲鱼养殖废水时也发现,藻菌联用技术对废水中TN的去除效果要优于微藻单养技术。此外，处理体系中添加适量的GR24(10-9mol·L-1)有利于体系中藻-菌共生体的增殖，因而除氮效果好；而添加量过多(10-7mol·L-1)、过少(10-11mol·L-1)或不添加(0 mol·L-1)均存在不利影响，因而导致除氮效果表现相对较差。磷既是微藻细胞膜组分磷脂的构成元素，也是为藻细胞功能发挥提供能量物质三磷酸腺苷的必要组分，因而同样可以在微藻的增殖过程中从废水中去除[29]。另一方面，灵芝菌(真菌)分泌的胞外多糖有助于微藻细胞被真菌颗粒捕获或附着在真菌菌丝上，使得真菌可以为微藻的生长提供更大的接受面，从而提高营养物质的去除效率[30]。

本研究在改变GR24浓度添加水平条件下，研究了小球藻-灵芝菌、小球藻单养两种藻类技术对水产养殖废水的生物净化效果。实验结果表明，外源添加GR24的最佳浓度水平为10-9mol·L-1；两种藻类技术处理体系相比较而言，小球藻-灵芝菌共培养系统显著提高了光合速率、生物量、废水中营养物质去除效果。在最佳条件下(GR24浓度为10-9mol·L-1)，水产养殖废水中COD、TN和TP的平均去除率分别为92.5%、94.9%和97.1%。本研究为微藻生物水产养殖废水提供了切实可行的微藻-真菌共培养策略。