哺乳动物种间嵌合体的研究进展

张景瑶，闫鑫鹏，高 帅，张 鲁*

（1.中国农业大学 动物科学技术学院，北京 100193；2.乌兰察布市畜牧工作站，内蒙古乌兰察布 012000）

在希腊神话中，嵌合体（chimera）是一种可怕的喷火野兽，有狮子的头部，山羊的身体和蛇的尾巴。在现代生物科学中，嵌合体是由来自不同生物体的细胞组成的生物，是极具价值的基础生物学研究工具。可移植器官的短缺阻碍了器官衰竭的治疗，每年有数以万计的患者在等待器官移植期间死亡，而种间嵌合体的研究将为再生医学开辟新的机会，促进人类疾病建模和大型动物体内的人体器官生成。

1 关于种间嵌合体的早期研究

嵌合体是指人工地将两个或两个以上具有不同遗传性状的早期胚胎，或者把具有特种遗传性状的细胞和早期胚胎聚合或显微注射所产生的生物。嵌合体不同于杂种（由不同物种之间的繁殖产生的后代）和镶嵌体（带有从相同合子起源的遗传细胞不同的动物）。根据细胞系分别来自相同物种还是不同物种，嵌合体可以分为种内或种间嵌合体。

关于哺乳动物种间嵌合体的研究最早起源于20世纪70年代。1973年，R.L.Gardner等第一次尝试用大鼠和小鼠的胚胎获得种间嵌合体，利用这一嵌合体作为研究哺乳动物胚胎发育过程中细胞谱系和细胞命运的工具。当将大鼠内细胞（inner cell mass，ICM）注入小鼠囊胚并移植入小鼠子宫后，可以用物种特异性抗体在胚胎切片中观察到大鼠来源细胞的分布；但是随着发育的进行，嵌合体中来自大鼠的细胞所占比例越来越少。这种细胞的损失尚不清楚；但有人认为，两个物种之间不同的发育速度可能是导致大鼠细胞难以继续增殖的原因。J.Rossant等在进一步的研究中，通过将卡氏小鼠（Mus caroli）的ICM注入小家鼠（Mus musculus）的囊胚，获得了由小家鼠与卡氏小鼠这两种不同种的啮齿动物细胞构成的种间嵌合体囊胚。将卡氏小鼠的囊胚注射入小家鼠子宫内时囊胚无法植入和存活；而且种间嵌合体的植入成功与否取决于滋养外胚层（trophectoderm，TE）细胞与母体子宫的物种起源是否匹配；除此之外，通过将卡氏小鼠的ICM与小家鼠TE重构的嵌合体囊胚注射入小家鼠子宫，首次得到可存活的哺乳动物种间嵌合体。由于种间嵌合体的ICM和TE来源于不同种小鼠，于是利用DNA-DNA原位杂交和两个物种之间卫星DNA的差异，分别描述了成年嵌合体不同组织中源自ICM 和TE的部分。因此，种间嵌合体的实现为研究细胞谱系提供了有效的模型系统。

在啮齿动物种间嵌合体培育成功之后，还产生了其他的种间嵌合体，第一个山羊-绵羊嵌合体由C.B.Fehilly等在20世纪80年代培育，在1990年诞生了第一个婆罗门牛与家牛的种间嵌合体。反刍动物种间嵌合体的培育结果与啮齿动物相似，同样表明只有TE和子宫来自同一物种，种间嵌合体胚胎才能正常着床和发育。并且虽然诞生的山羊-绵羊嵌合体后代的表型是山羊和绵羊的混合特征，但与胚胎的宿主物种更为相似。总而言之，这些早期研究为了解胚胎发育过程中物种间的保守与不同打下了良好的基础。

2 干细胞与种间嵌合体

随着干细胞技术的发展，科研人员从早期胚胎的ICM中获得了胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞），通过细胞重编程从分化的细胞获得了诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。得益于这两种多能性干细胞（pluripotent stem cell，PS细胞）的产生，人们有了更高效地产生嵌合体的材料，这也重新激起了种间嵌合体的研究热潮。

2008年，研究人员通过将姬鼠的ES细胞注射入小家鼠的囊胚，获得了首个由多能干细胞构成的种间嵌合体，在嵌合体小鼠的所有主要器官（包括生殖细胞）中，姬鼠的细胞都占很大的比例（在某些组织中达到40%）。并且姬鼠与小家鼠嵌合体在眼睛大小及跳跃性等表型上显示出介于两个物种之间的中间特征。小鼠ES细胞培养条件的改进最终促成了具有生殖能力的大鼠ES细胞的生成。同在2008年，Ying Q.L.等通过改善培养条件，获得了具有自我更新、自我复制能力的真正的大鼠ES细胞，并描述了干细胞多能性的基态（ground state）。T.Kobayashi等通过将大鼠PS细胞注射到小鼠囊胚中，并将小鼠PS细胞注射到大鼠囊胚中，成功获得了成年的小鼠-大鼠种间嵌合体，且嵌合体的功能性胰腺完全由大鼠PS细胞发育而来，证明了种间囊胚互补产生异种器官的可行性。首先，在研究中发现小鼠-大鼠种间嵌合体的生成效率（胚胎发育率和嵌合度）低于种内嵌合体。其次，研究人员发现注射PS细胞的嵌合率要高于注射ICM，而PS细胞在发育后期的嵌合体胚胎中占比更高，这表明大鼠PS细胞可能比ICM更具有生长优势，而这可能是由于体外培养恢复了细胞的多能性。第三，除异种PS细胞在嵌合体中占比非常高的情况外，通常由大鼠代孕的嵌合体大小与大鼠相同，而由小鼠代孕的嵌合体大小与小鼠相同，这解释了为何异种PS细胞占比过多常常导致形态异常及胚胎致死。第四，异种细胞在不同器官组织的嵌合效率似乎存在物种偏好。研究人员在大鼠囊胚来源的嵌合体肝脏中检测到高百分比的小鼠CD45细胞，但在小鼠囊胚来源的嵌合体胎儿中很少检测到大鼠CD45细胞。但该观察结果仅限于种间嵌合体，因为相同的大鼠PS细胞系在种内嵌合体胎儿肝脏的CD45细胞中有很高的占比。最后，在该研究中还发现，小鼠-大鼠嵌合体胎儿中胆囊的存在与否（小鼠体内有胆囊，而大鼠没有），似乎是由囊胚所属物种决定的，这表明供体PS细胞的发育分化受宿主发育程序的调控，而这些发育程序会驱动器官的发生。

而在之后的研究中，Wu J.等发现，大鼠PS细胞可能参与了种间嵌合体胆囊的发育。在嵌合体的胆囊中检测到大鼠细胞的存在，这表明小鼠胚胎微环境能够解锁大鼠细胞的胆囊发育程序，而该程序在大鼠发育过程中通常受到抑制。但小鼠囊胚来源的嵌合体中大鼠PS细胞的高占比是否会干扰小鼠胆囊的发育仍是一个未解决的问题。除此之外，他们通过将大鼠ES细胞及可以分化为生殖细胞的iPS细胞注射到猪囊胚中，并将嵌合体囊胚注射到受体母猪子宫中，发现虽然啮齿动物原始态（naïve，具有植入前胚胎特征）的PS细胞可以形成啮齿动物间特异的种间嵌合体，但这些细胞无法形成正常发育的大鼠-猪种间嵌合体胚胎。而将人类的PS细胞移植到猪胚胎中可以形成嵌合体（尽管嵌合效率非常低），但将人的PS细胞移植到啮齿动物胚胎中时无法获得嵌合体，这说明进化距离对于产生种间嵌合体的重要性。同时该理论也使科学家首次成功培育出人-猪嵌合体胚胎，并在猪体内发育了21～28 d的时间。

2019年，通过分别培养三种状态：始发态（primed，具有植入后胚胎特征）PS细胞、中间态（intermediate，特征介于植入前与植入后胚胎之间）PS细胞以及原始态（naïve）PS细胞，筛选用于嵌合体的最佳多能性干细胞。并通过优化干细胞培养和嵌合体系，增强食蟹猴胚胎干细胞的抗凋亡能力，从而改善嵌合胚胎的发育，最终成功获得了两个食蟹猴-猪嵌合体，这也是科学家首次获得灵长类与猪的活体嵌合体。而在2021年，科学家首次获得了人-猴嵌合体。人的ES细胞可以嵌合入食蟹猴胚胎，并且可以进入原肠运动，表达中、内胚层的标记基因。但人的ES细胞很难在食蟹猴胚胎中分化为TE细胞，而较容易分化为上胚层细胞，这一发现与之前的人-鼠嵌合体试验不同。通过进一步结合单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing，scRNA-Seq）技术，研究人员发现，随着胚胎的发育，人ES细胞的表达状态与受体食蟹猴胚胎细胞越来越相似，并且细胞之间的互作也增强了。这些互作涉及到PI3K-Akt和MAPK等信号通路，且人ES细胞在种间嵌合体胚胎中的发育进程减缓可能也与这些通路相关。

由于PS细胞的来源有限，研究人员尝试用分化能力更有限的干细胞／祖细胞形成种间嵌合体。通过将由PS细胞分化而来的大鼠和人类神经嵴细胞移植到小鼠E8.5胚胎中，成功获得了活的种间神经嵴嵌合体。并且成年嵌合体小鼠出现有色毛发，说明供体细胞能够分化为功能性黑素细胞。研究人员还将人类神经干细胞移植到大鼠胚胎中，产生了种间嵌合大脑。而利用囊胚互补技术，在大动物体内产生了外源性器官。胰腺发育障碍的猪囊胚用同种异体卵裂球进行补充，产生的成年猪嵌合体拥有完全来自供体的胰腺。得益于这些前期工作，目前科学家已经成功在大动物体内培育了人源的内皮细胞及肌肉组织。

3 异种干细胞与宿主囊胚嵌合度的影响因素

3.1 供体细胞与宿主组织发育阶段是否相匹配

供体细胞移植到发育阶段匹配的宿主组织中对于成功嵌合至关重要。小鼠胚胎干细胞能够在囊胚注射后继续发育，但不能嵌合于植入后的胚胎上胚层。相反，尽管小鼠上胚层来源干细胞（epiblast stem cell，EpiS细胞）在生产囊胚嵌合体方面效率低下，但在将它们移植到小鼠E7.5胚胎的上胚层时很容易产生嵌合体。并且能够增殖分化成三个胚层及原始生殖细胞，但不能有效地整合到E8.5胚胎中，这是由于该阶段胚胎的多能性已经丧失。

3.2 是否为供体细胞提供选择优势

首先，如果宿主细胞经过遗传修饰，损害或阻止了某些细胞谱系的发育，则受体位置只能由供体细胞增殖分化形成，并且功能由供体细胞物种决定，这可以帮助提高该位置供体细胞的嵌合率。例如将造血干细胞在移植到接受致命照射的受者体内后能够同时保留自我更新和多谱系分化能力，将ES及iPS细胞产生的原始生殖样细胞注射入缺乏内源性生殖细胞的小鼠睾丸内，可以分化为精子。值得注意的是，Wu J.等利用CRISPR-Cas9技术编辑宿主胚胎以阻止目标器官的形成，此举更加快速、便捷地实现了不同物种间的囊胚互补，并且这项技术可以用于多谱系互补。

其次，改变受体组织的状态，创造有利于供体细胞存活生长的环境。H.Masaki等发现，来源于上胚层的EpiS细胞能够产生囊胚嵌合体，是由于它们对注入囊胚后的细胞死亡具有抗性。进一步研究发现，过表达抗凋亡蛋白BCL2的EpiS细胞能够整合入小鼠囊胚并有助于嵌合小鼠的产生。并且过表达BCL2的SOX17内胚层祖细胞能够嵌合入囊胚中，但仅存在于成年嵌合体小鼠的肠道组织。这些结果表明，抑制凋亡能够促进供体PS细胞在植入前胚胎中的存活，并且可以提高囊胚嵌合体与供体细胞异时性的相容度。一旦达到适当的分化阶段，嵌合入胚胎的PS细胞便会参与胚胎发育并按照其发育命运分化。阻止细胞凋亡也有利于形成小鼠-大鼠种间嵌合体，表达BCL2蛋白的大鼠primed状态PS细胞可以在注射入小鼠囊胚后形成嵌合体。

除此之外，T.Nishimura等通过敲除宿主细胞中Igf1r基因在小鼠胚胎中创造了一种“细胞竞争微环境”，大大增加了啮齿动物种内和种间嵌合体中供体的嵌合效率，并且Igf1r缺失不会导致胚胎早期发育阻滞，因此通过这种方式可以产生具有功能性嵌合器官的胎儿。

3.3 物种间进化距离

研究人员发现，与小鼠和大鼠之间的种内和种间嵌合体相比，人-动物嵌合胚胎的嵌合效率显著降低。这种物种间屏障的原因尚不清楚，但是可能存在多种原因，包括配体-受体不相容以及遗传多样性导致黏附分子亲和力的差异。并且当将相较于大鼠与小鼠遗传距离更远的草原田鼠（Microtus ochrogaster）的iPS细胞注射到小鼠囊胚中时，可以产生种间嵌合体，但是胚胎发育速率、嵌合性和成年存活率低于小鼠-大鼠嵌合体，这表明遗传多样性或进化距离是造成异种屏障的重要原因。

2021年，Zheng C.等发现了一种物种间细胞竞争的新模式。在共培养体系中，作为“失败者”的人多能干细胞被“优胜者”小鼠多能干细胞通过细胞凋亡的形式清除，而这种竞争力状态似乎与物种间进化距离密切相关。但不同物种间naïve状态及分化后的PS细胞并不存在这一模式，并且不同物种之间primed状态干细胞的竞争状态不同。大小鼠之间和人猴之间的竞争力相似，未发现明显的细胞竞争现象，但大小鼠、人猴和牛之间primed状态干细胞之间相对竞争状态是不同的，这种竞争状态的不同会导致细胞竞争的发生。

4 应用与展望

种间嵌合体是研究发育、机体稳态、干细胞潜能和疾病的优秀实验模型。种间嵌合体的应用可能存在以下几种方向：（1）提供嵌合体来源的人类器官。利用基因操作技术，可以通过种间囊胚互补或种间靶向器官互补产生人类器官，帮助解决全世界器官供体严重短缺的难题。2010年，T.Kobayashi等在研究中成功在小鼠体内产生了完全来自大鼠的胰腺，使用大鼠iPS细胞补充无法发育出胰腺的小鼠胚胎中的胰腺器官。以这种方式从PS细胞生成的器官与动物的原始器官具有相同的功能。而使用囊胚互补进行人体器官生产，需要使用大型动物宿主，猪、羊、猴可能是比较合适的选择，因为它们的器官大小与人类相似。目前已产生了Pdx1敲除的基因编辑绵羊，可能作为种间器官生成的宿主。尽管取得了这些进展，但要实现在动物身上产生用于移植的人体器官的梦想还有很长的路要走。（2）用于体内疾病建模。实验生物学的一个重要目标是开发允许在体内条件下研究人类疾病的模型系统，转基因动物成功地模拟了多种人类疾病，但未能为如帕金森氏症或阿尔茨海默氏症等复杂的疾病提供与疾病相适应的表型。鉴于疾病特异性iPS细胞能够携带导致疾病病理学的所有遗传改变，因此人类干细胞产生的人类-宿主动物种间嵌合体可以用作疾病建模，帮助研究人员更好地了解人类疾病的病因、发病时间和进程；另外作为药物筛选平台可以用于在体内环境测试候选药物的功效和安全性，具有很高的临床应用价值。

但关于嵌合体的研究和人类临床应用仍存在一些伦理和社会问题，包括动物福利、供体细胞来源、公众对嵌合体的不认可及对人类-非人嵌合体可能“人格化”的担忧。目前人们难以预测嵌合体动物在试验过程中可能遭受的疼痛或残疾，因此研究人员必须对嵌合体比对待现有的实验动物更谨慎。并且尽管目前生产嵌合体用于生物学研究是合法的，但有些人认为制造嵌合体使用人类ES细胞或源自流产胎儿的细胞是不道德的。除此之外，人类与非人类嵌合体最有争议的方面是担心来自人类的细胞可能赋予嵌合体一些人类特征，产生具有人类生殖细胞和智力的动物。