昆明西山风景区土壤淡色丝孢菌多样性分析

许俊杰，董 悦

(临沂大学医学院，山东临沂 276000)

淡色丝孢菌隶属于真菌界淡色丝孢菌科，是世界性广泛分布种。在已知的全部丝孢真菌属种中，淡色丝孢菌占40%～45%[1]，其中很多属种都是重要的植物病原菌，可以危害多种经济作物；除危害植物外还可以用于生物防治，也可以产生抗菌、抗肿瘤等次生代谢物。昆明西山风景区位于有“高原明珠”之称的滇池湖畔，地势北低南高，最高峰海拔2 507.5 m。西山森林公园具有丰富的植物多样性，是滇中地区颇具典型性的山地环境，植物多且集中，分布有167科、59属、1 086种灌乔木和其他植物。此外，此地还生长了一些珍稀树种，如台桧、鹅耳枥、化香树、八角枫、滇紫荆等四季常青的树木。四季如春的气候、丰富的植物资源、典型的地理环境决定了昆明西山风景区土壤中具有丰富的真菌资源，因此，开展土壤淡色丝孢菌的研究具有重要的意义。通过昆明市西山风景区土壤淡色丝孢菌多样性的研究，旨在为挖掘淡色丝孢菌资源提供理论指导和资源支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集土壤、植物残体样品采集自云南昆明西山风景区竹林、防护林、草坪、山坡林、菜田、农田。按蛇形采样法，每个样地于0～30 cm处进行土壤采集，各采样点铲取土样15份，装于密封袋中，编号，同时记录采样时间、地点、生境及经纬度。土样带回后置于阴凉处风干，将编号相同的土样混合为1份，每个采样点混合好取3份土样作为平行试验组，共18份土壤样品。置于冰盒中保存24 h内送往实验室，于4 ℃保存。

1.2 培养基分离培养基为水琼脂+秸秆培养基；纯化培养基为PDA培养基。发酵培养基为PDB液体培养基(葡萄糖20 g、马铃薯200 g、琼脂15 g、水1 000 mL)[2]。

1.3 土壤真菌的分离、纯化利用稀释涂布平板法[3]进行土壤真菌的分离，每个处理设3个重复，涂布后置于25 ℃温箱内培养4～7 d后，对长出的菌落进行统计、编号、分离、纯化、保存。将纯化菌株接种PDA培养基平板上，每隔24 h观察菌落形态、颜色、培养基颜色，用载玻片培养法[4]观察其形态学特征。

1.4 土壤真菌群落数据分析方法

1.4.1物种丰富度。即群落中的物种数，在此指各生境采集的土壤样品中分离得到的淡色丝孢菌的属级物种数，以S表示。

1.4.2种群优势度。以Berger-Parker优势度指数(di)进行计算，其公式如下：

di=Ni/N

(1)

式中，N为物种总数，Ni为第i物种个体总数(该研究中以属为单位统计菌落数)。

1.4.3物种多样性。以Shannon-Wiener多样性指数公式进行计算，其公式如下：

(2)

式中，H′为物种的多样指数，n为物种(该研究中为属级分类单位)总数，pi为第i种物种个体数占群落总个体数的比例[5]。

1.4.4物种均匀度。采用 Pielou 指数测定公式[5]计算物种均匀度，其公式如下：

J=H′/lnS

(3)

式中，J为均匀度，H′为Shannon-Wiener多样性指数，S为物种总数。

1.4.5相似性分析。采用 Jaccard系数公式[5]进行相似性分析，其公式如下：

Cj=J/(a+b-J)

(4)

式中，J为群落A与群落B共有的物种数，a为群落A含有的全部物种数，b为群落B含有的全部物种数。

1.5 数据统计用Excel 2003和DPS 7.5统计分析软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 土壤真菌在不同生态环境中的分布情况从表1可以看出，6种不同类型的生态环境土壤中，真菌的物种组成与分布存在明显差异。防护林土壤中真菌属种总数最大，为300株，淡色丝孢菌173株。其中，木霉属真菌67株，镰刀菌属46株，青霉属28株，支顶孢属32株；草坪中真菌共有194株，淡色丝孢菌149株，其中木霉属78株，镰刀菌属32株，青霉属26株，支顶孢属13株。山坡林土壤中真菌共有176株，淡色丝孢菌115株，其中木霉属42株，镰刀菌属41株，青霉属24株，支顶孢属8株。竹林土壤中真菌共有170株，淡色丝孢菌85株，其中木霉属30株，镰刀菌属30株，青霉属16株，支顶孢属9株；菜田土壤中真菌共有103株，淡色丝孢菌73株，其中木霉属17株，镰刀菌属29株，青霉属19株，支顶孢属8株；农田土壤中真菌共有179株，淡色丝孢菌131株，其中木霉属79株，镰刀菌属23株，青霉属27株，支顶孢属2株。其他种类的真菌在6种生境中分布各有不同，除节菱孢属和链格孢属数量较多外，其他分布较少。淡色丝孢菌共726株，为土壤真菌菌落中的优势种群。

表1 不同生态环境中土壤的淡色丝孢真菌及其他物种组成和分布

2.2 昆明西山风景区土壤淡色丝孢菌属的组成及优势度从采集的18份土壤样品中分离获得土壤真菌18属1 122株，其中淡色丝孢菌726株(表1)。18个属分别为青霉属Penicillium、镰刀菌属Fusarium、盾壳霉属Trichothecium、木霉属Trichoderma、脉孢菌属Neurospora、节菱孢属Arthrinium、帚霉属Scopulariopsis、链格孢属Alternaria、弯孢属Curvularia、聚单端孢属Trichothecium、酵母属Pichia、支顶孢属Acremonium、葡孢霉属Botryosphaeria、盘多毛孢属Neopestalotiopsis、毛色二孢属Lasiodiplodia、黑孢霉属Nigrospora、壳囊孢属Cytospora、未知菌属。其中，青霉属、镰刀菌属、木霉属和支顶孢属为淡色丝孢菌。

参考昆虫物种优势度(di)的划分标准，di>0.10为优势属，0.01

表2 不同生境中土壤淡色丝孢菌及其他物种的优势度

2.3 昆明西山风景区生境中土壤淡色丝孢菌群落多样性从表3可以看出，土壤淡色丝孢菌在昆明西山风景区6种不同生境中的物种丰富度存在较明显差异，防护林生境中物种丰富度最高(18)，它包含了18属，其次为山坡林丰富度(16)，菜田生境中物种丰富度最低(10)，而农田、菜田、草坪和竹林生境的物种丰富度较接近。山坡林和防护林生境中土壤淡色丝孢菌的H′指数均大于2，而其他4个生境中的多样性指数略低，但是均大于1.78。菜田的均匀度最大(0.864 5)，农田的均匀度最小(0.694 9)，其他生境的均匀度非常接近。防护林土壤中多样性指数、物种丰富度和物种数均最大，说明防护林人为干扰活动少、土壤物种稳定；菜田土中物种丰富度和物种数均最小，说明人为活动和耕作方式等影响真菌的数量和种类。防护林、山坡林的H′指数均较大，说明这种生境的土壤中有机质和腐殖质等营养较为丰富，较适合真菌的生长与繁殖。草坪、竹林、农田和菜田土真菌H′指数相对较低，说明其生境植被种类单一，可能会导致真菌数量和种类减少。从均匀度看出，菜田土真菌均匀度最大(0.864 5)，农田土真菌均匀度最小(0.694 9)，其他类型的生境中真菌均匀度介于菜田土和农田土之间，也较为相近。由表3可知，不同生境中淡色丝孢菌数量和物种数各不相同，说明淡色丝孢菌的数量与土壤结构、营养成分等因素密切相关。

表3 不同生态类型土壤中淡色丝孢菌及其他物种的群落特征

2.4 昆明西山风景区土壤淡色丝孢菌不同生境类型的群落相似性根据Jaccard相似性系数原理，当相似性系数(Cj)为0～0.25时，为极不相似；当0.25

表4 土壤淡色丝孢菌在不同生境类型的群落相似性

3 结论与讨论

陆地真菌资源丰富，截至2000年，陆地真菌总数约5万种[7-9]。该研究首次对昆明西山风景区土壤淡色孢菌资源及其群落结构进行了研究，共分离得到1 122株真菌，其中淡色丝孢菌726株，主要包含于镰刀菌、支顶孢、青霉和木霉4个属之中。这虽然初步揭示了该地区真菌种群的分布特征，但从数量和种类上讲挖掘的远远不够。目前各个领域针对微生物菌群多样性的分析方法主要分为培养法和非培养法2种，其中培养法由于条件限制只能分离鉴定出少数微生物。自然界中只有0.1%～1.0%的微生物通过常规方法能被培养，说明应用传统分离培养方法导致了微生物多样性的严重丢失。因此，非常有必要应用非培养[10-12]的分子生物学方法来研究土壤中的真菌菌落组成，以此达到较为完整地获取土壤中真菌多样性信息的目的，同时也期望将来能找到一套更为科学的分离培养方法，从土壤中挖掘出更多的淡色丝孢菌。

生态学多样性测定的局限性在于取样地点和取样本数量的局限性，在一个生态区域取样时，只能按照统计学取样要求进行定点取样，样本数量虽然能够反映出土壤中微生物的大部分信息，但是却包含不了其中所有的种类。综上所述，要想准确分析土壤中淡色丝孢菌的多样性，必须改进真菌分离方法，采用多种手段相结合的方式对微生物多样性进行合理分析。