根际促生菌S1菌株的分离鉴定及促生效果

吕朝阳，王 威，杨淼泠，施李鸣，张 维，张克诚，葛蓓孛

(中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

根际土壤是土壤中各种物质和养分从无机环境进入植物的重要媒介，它受植物根系分泌物、微生物与土壤之间的相互作用[1]，根际土壤微生物作为土壤-植被生态系统中最活跃和具有决定性影响的组分之一，不仅能够参与并调节植物在生长发育中的各个环节[2-3]，还在土壤的能量流动、养分循环及有机物质转化中发挥着重要作用。其中，根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在植物体内，附生于根系或根际土壤中的一类对病原菌有生防作用，能够促进植物吸收矿物质等无机物，并产生有利于植物生长的化合物的有益菌，这类土壤益生菌通常也具有生物固氮、产生植物激素和抗生素等能力[4-6]。PGPR由于对植物病害具有显著防效，并能够促进作物的生长发育及增加产量而受到研究者的关注，成为根际微生物研究的热点。引入外来微生物定植到根际能够直接影响根际微生物的数量和结构，或者通过调控植物的代谢和根分泌物组分而间接影响植物根际微生物结构，进而影响植物的生长发育、抵抗病原微生物的能力等[7-10]。

互花米草(Spartinaalterniflora)，禾本科米草属多年生植物，其茎秆粗壮且根部发达，能够深扎于土壤中以促进泥沙的快速沉降和淤积，因此被许多国家地区引进[11]。但互花米草的过度扩散对生态系统造成严重影响，已成为生物入侵研究的焦点之一[12]。研究发现，互花米草能够改变土壤微生物群落，提高根际微生物的丰富度[13-15]。因此，在互花米草根际土壤中更有可能筛选出更多种类的根际促生菌，为研发新型绿色微生物肥料和生长调节剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1土壤样品。试验土样采集于广西北海互花米草根际土壤，拨去表层约5 cm厚的土壤，用小铲采集根际土壤并将其装入无菌采样袋中，标注好采样时间和地点，带回实验室置于冰箱中-4 ℃保存备用。

1.1.2番茄品种。试验所用番茄品种为改良毛粉802，购自山东安信种苗股份有限公司。

1.1.3培养基。生长素产出菌筛选培养基：R2A(M1)；菌株溶磷能力筛选培养基：蒙金娜无机磷培养基(M2)；微生物分离培养基：LB固体培养基(M3)；菌株产IAA能力筛选培养基：Salksowski 比色液(M4)。培养基的配制成分与含量见表1[14]。

表1 培养基及其组分

1.2 试验方法

1.2.1根际微生物的分离与筛选。

1.2.1.1菌株的富集和分离。取2 g土壤样品加入18 mL无菌水，在摇床上振荡培养1 h后静置10 min，使形成的土壤悬浮液分层。取2 mL上清液于LB液体培养基中，在摇床上振荡24 h进行富集培养。取1 mL富集后的菌株悬浮液，用无菌水将悬浮液浓度调节至1×10-2CFU/mL，之后采用梯度稀释法将浓度稀释至1×10-7CFU/mL，分别吸取各梯度土壤悬浮液 200 μL，依次滴加至ACC筛选平板上，用无菌涂布棒均匀涂布至干燥，每个处理设置3个重复。将完成涂布分离的平板倒置培养在34 ℃的培养箱中2～3 d。

1.2.1.2菌株的筛选。观察菌落生长情况，依据菌落的生物特征、气生菌丝等特点筛去重复菌株。将筛选的单菌落挑取至含色氨酸的R2A液体培养基中，置于30 ℃ 200 r/min摇床上振荡培养24 h。

(1)细菌溶磷能力的筛选。振荡培养后分别吸取1 μL孢子悬浮液，点接在蒙金娜无机磷平板中央，于34 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h。观察菌落周围是否出现溶磷圈，溶磷圈越大，则该菌株溶磷效果越强。

(2)细菌产IAA(吲哚乙酸)能力的筛选。将待测菌株在含有色氨酸的液体LB培养基中培养7 d后，取上清液离心10 min，将离心后的上清液与Salksowski比色液在96孔板上1∶1混合进行显色反应，将96孔板置于38 ℃条件下避光保温40 min，观察颜色变化，颜色越深说明该菌株产IAA的能力越强。

将筛选出的既有产IAA能力又有溶磷效果的菌株，采用平板划线法进行纯化，并保存在甘油中，放置在-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2菌株生理生化鉴定。采用平板划线法将菌株S1在LB培养基上培养出单菌落，观察菌落颜色、形态及菌体的形态，并采用细菌微量生化鉴定管对菌株S1进行生理生化鉴定试验。

1.2.3菌株分子水平鉴定。

1.2.3.1总DNA提取及PCR扩增。使用细菌全基因组DNA提取试剂盒及细菌通用引物提取S1菌株的总DNA。

1.2.3.2PCR产物检测、纯化与测序。用移液枪取5 μL扩增后的PCR产物与1 μL 6×Loading buffer混匀，加样于凝胶样孔中进行电泳。约30 min后，将电泳好的凝胶取出放置在紫外透射仪下进行检测，在约1 300 bp处看到1条亮带，说明扩增成功。将扩增后的序列送至擎科科技有限公司测序。

将测序得到的结果输入NCBI数据库进行BLAST比对，选取相似度最高的一些种属并下载其16S rRNA基因序列，利用这些序列在MEGA 7.0软件中构建系统发育树。

1.2.4菌株发酵液的制备及计数。将菌株接种在LB固体培养基上，在28 ℃恒温培养箱中倒置培养，培养1 d后，接种于LB液体培养基中，28 ℃ 220 r/min 振荡培养1 d，然后在离心机中28 ℃ 6 000 r/min离心6 min，得到的上清液即为细菌发酵液。

用梯度稀释法将细菌发酵液浓度依次调节至1×10-9CFU/mL，每个浓度吸取100 μL细菌发酵液，依次滴加在LB固体培养皿上均匀涂布，用无菌涂布棒均匀涂布至干燥，每处理设置3个重复。将完成涂布分离的平板倒置在28 ℃ 培养箱中培养1 d，找出在培养皿上长出10～100菌落数的处理，计数并求平均值。

1.2.5菌株对番茄种子萌发的影响。用无菌水将番茄种子洗净并浸泡4 h，控干水分后，用0.4%高锰酸钾浸泡10 min，之后用无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分。取5个50 mL无菌离心管，每个离心管放入50粒处理后的番茄种子，将已过滤的浓度为1×107CFU/mL菌株发酵液按10、100、500、1 000、2 000倍稀释后分别得到浓度为1×106、1×105、2×104、1×104、5×103CFU/mL的发酵液，以添加相同体积、稀释倍数相同的LB液体培养基和无菌水浸泡作为对照组，每处理重复3次。将各处理放置在25 ℃、相对湿度为90%的光照培养箱中，设置光照为12 h/d。为确保种子湿润，每天定期喷少量无菌水。以发芽试验当天记作0 d，8 d后统计发芽势，10 d后计算发芽率，利用公式计算发芽指数和活力指数[16]。

发芽率=前10 d发芽的种子数/供试种子总数×100%

发芽势=前8 d发芽的种子数/供试种子总数×100%

式中，Gt为发芽试验终期每日发芽数；Dt为发芽日数。

活力指数V=GP×GI

式中，GP为幼苗的生长势，该试验以幼苗平均根质量计。

1.2.6菌株对盆栽番茄幼苗生长的影响。将番茄种子催芽后播种于装有营养基质的盆中，每盆1株，待番茄苗长出2片真叶时，将发酵好的浓度为1×104、2×104CFU/mL的菌液和浓度为1×104、2×104CFU/mL的LB液体培养基每株 10 mL 缓慢灌入番茄苗根部；将10 mL清水注入番茄苗根部土壤中作为空白对照，每处理20株苗，每处理设置3个平行试验，处理完毕后放置在30 ℃温室中培养。每隔7 d各处理再分别进行一次灌根处理，累计灌根5次后取样，小心清洗根部土壤，统计株高、根长和鲜重。测量完毕后将番茄幼苗置于60 ℃烘箱中，烘干水分后测量干重。

1.3 数据处理采用 MEGA 7.0软件和邻接法(Neighboring-Joinning，NJ)构建系统发育树；采用SPSS 24.0(IBM，Armok，NY，USA)统计软件对番茄农艺指标进行单因素方差分析和LSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 互花米草根际土壤细菌菌株分离结果通过前期初筛并纯化获得了10株细菌菌株(表2)。测量各细菌菌株在蒙金娜无机磷固体培养基中溶磷圈直径，发现Gx-Ⅰ7菌株的溶磷圈直径最大，为3.35 cm，其次为Gx-Ⅰ1，为3.24 cm。利用IAA标准曲线基于各菌株发生显色反应后的OD530值计算得到IAA浓度，结果表明，菌株-Gx-Ⅰ1和Gx-Ⅰ5 IAA浓度相对较高，IAA浓度分别为7.20和6.81 μg/mL。综合溶磷及分泌IAA能力2个指标，选取溶磷及产IAA能力均较强的菌株Gx-Ⅰ1进行深入研究，并将其命名为菌株S1。

表2 互花米草根际土壤细菌溶磷及产IAA能力筛选

2.2 菌株S1的鉴定

2.2.1形态及生理生化特征。菌株S1在LB培养基上的菌落呈乳白色，圆形，表面光滑、湿润，革兰氏染色结果为阴性，菌体形态为杆状。细菌微量生化鉴定检测结果表明(表3)，菌株S1对尿素、枸橼酸盐、动力、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、葡萄酸盐、产气试验呈阳性，对甲基红、靛基质、硫化氢、苯丙氨酸、侧金盏花醇 、赖氨酸、木糖、革兰氏染色均为阴性。

表3 互花米草根际土壤分离的细菌菌株S1的生理生化特征

2.2.2分子生物学鉴定。将细菌S1的16S rRNA片段扩增后长度约1 300 bp(图1)。扩增后的片段测序后将序列提交至NCBI数据库进行BLAST检索和比较，得到相近种属的16S rRNA序列，利用这些序列构建系统发育树(图2)。结果表明，该分离菌株与阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)同属于一个分支，亲缘关系较近，同源性达到99%，结合生理生化鉴定将该菌株暂定为阴沟肠杆菌。

注：M.DL 5000 DNA梯带；1～2.细菌扩增片段；目的条带约1 300 bp

图2 菌株S1及相关细菌16S rRNA序列的系统发育树

2.3 菌株S1对室内番茄种子萌发的影响番茄种子萌发的测定结果见表4。表4表明，菌株发酵液浸泡处理组中，1×104CFU/mL的发酵液能够显著促进种子萌发，发芽率为72.20%，发芽势为72.22%，发芽指数为26.23，活力指数为95.48，相比于CK分别提高了88.36%、106.34%、159.19%、113.46%。发酵培养基浸泡处理组中，2×104、5×103CFU/mL的发酵培养基对种子萌发有促进作用，其中5×103CFU/mL发酵培养基效果最好，相比于CK组发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数分别提高了41.93%、52.37%、69.47%、6.44%。以上分析表明，发酵培养基和菌株发酵液在一定浓度下均能促进种子萌发，其中1×104CFU/mL菌株发酵液促进种子萌发的效果最佳。

表4 S1菌株发酵液对番茄种子萌发的影响

2.4 菌株S1对盆栽番茄幼苗生长的影响发酵液对室内番茄幼苗生长的影响见图3。番茄各生长指标的测量结果(表5)表明，经菌株发酵液和发酵培养基处理过的菌株，其根长、株高、鲜质量、干质量均高于CK。说明2种处理均可以促进番茄幼苗的生长，试验数据显示，S1菌株发酵液浓度为1×104CFU/mL时，对番茄的促生作用最为显著，与CK相比，根长、株高、鲜质量和干质量分别增加了63.79%、74.66%、155.17%和150.00%。

表5 菌株发酵液对番茄生长的影响

3 讨论

PGPR可通过多种作用机制促进作物的生长发育并提高产量，如改善植物根际的营养环境，增强植物的固氮能力；通过分泌各种植物激素、维生素或氨基酸等促进植物生长；产生抗生素和胞外溶解酶等抑制病原菌的生长，减轻对植物的危害[17-19]。利用PGPR制成微生物肥料可缓解因化肥的过度使用而造成的环境污染问题[20]，特别是近年来农业部提出化肥零增长的要求，使得农业上对绿色高效的微生物肥料的需求更为迫切。因此，利用PGPR研发出新型环保的微生物肥料和植物生长调节剂对农业的发展具有重要意义。该研究从广西北海互花米草根际土壤中分离获得1株具有溶磷及分泌IAA能力的菌株阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，其发酵液在1×104CFU/mL时能够显著促进番茄种子萌发和幼苗生长。研究表明，IAA可调控植物的生长发育过程，特别是对植物次生根的发育具有明显促进作用。因此，若接种的根际促生菌能够产生大量IAA，则能诱导植物产生大量的次生根，从而建立起植物幼苗根系的稳定发育系统，使幼苗能够健康快速生长[21-22]。具有溶磷功能的细菌可分泌有机酸与部分金属离子鳌合，将土壤中难溶性磷转化为可溶性磷，供植物吸收，促进植物生长[23]。该研究发现的植物促生菌为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，隶属肠杆菌属，目前已报道的植物根际促生菌大多属于芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Psewdomonas)，此外，还包括黄杆菌属(Xanthomornas)、节杆菌属(Arthrobacter)、伯克霍氏菌属(Burkholderia)、弗兰克氏菌属(Frankia)、固氮菌属(Rhizobium)等[24]，现阶段国内外鲜见将阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)作为植物根际促生菌的相关报道。综上所述，该研究发现的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)具有良好的生防应用前景，可丰富植物促生菌的种类，以期为开发研制新的微生物源植物生长剂及微生物肥料提供原材料。

4 结论

通过平板初筛、盆栽试验及16S rRNA分子鉴定技术筛选出1株根际优良促生菌株阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，兼具溶磷、分泌生长素性能，该菌株对番茄种子的萌发及幼苗的生长有显著的促进作用。