一个新合成化合物对烟草诱抗烟草花叶病毒的影响

崔顺艳，王 悦，辛雪成，张文军，魏婷婷

(沈阳化工研究院有限公司，辽宁沈阳 110021)

植物体内的免疫机制，如同人类注射疫苗，经诱导因子处理后，植物体内的免疫体系被快速激活来防御外源病原体的侵染。烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是一种RNA病毒，在烟草生长过程中，一类最为普遍发生的病害，对烟草质量造成严重影响。近年来，各国学者对TMV的防治进行了大量研究，与化学药剂防治措施相比，作物免疫调控抗病有诸多优点，引起各界的广泛重视。茉莉酸甲酯是一种植物生长调节剂，对植物的生长发育极为重要，涉及多种生理过程，如生长、发育、代谢等，且是植物抗病信号的传递体之一[1 - 2]。禹艳红等[3]研究表明用茉莉酸甲酯处理,能提高抵抗黄瓜花叶病毒的侵染，还指出烟草对黄瓜花叶病毒的抗性与SOD活性有较强的相关性。宾金华等[4]指出茉莉酸甲酯的施用能明显提高烟草的LOX活性、病源相关蛋白含量等，这些指标的变化与提高抗性密切相关。

笔者研究了新合成的化合物——茉莉酸甲酯类似物B2对TMV侵染烟草的抑制效果，通过测定调控茉莉酸信号途径的NtRab11基因、茉莉酸信号通路中的关键基因COI1、植物抗病基因PR-1a和PR-1b的相对表达量探讨了新合成化合物B2的诱导抗病机制。

1 材料与方法

1.1 材料供试品种为普通烟NC89; 烟草花叶病毒(TMV)由沈阳中化农药化工研发有限公司生测研发部提供。

试验药剂为新合成的化合物，为N-(4-甲基苯基)-2-(3-氧代-2-戊基环戊基)乙酰胺。该化合物为茉莉酸甲酯类似物，因此该研究选取茉莉酸甲酯作为阳性对照药剂，其结构式见图1。

图1 茉莉酸甲酯结构式

1.2 方法

1.2.1试验前处理。将新化合物B2和阳性对照药剂——茉莉酸甲酯先用二甲基亚砜溶解，然后配制成500 mg/L的溶液，选取长势一致的5 ～ 6片叶龄的烟草植株上施药，对照喷洒清水。

于药剂处理3 d后接种烟草花叶病毒，每株接种施药叶片以上的第一片叶片。接种方法为摩擦接种，制备接种毒液：称取1 g新鲜带病毒叶片，以100 mL (pH 7.0) 的磷酸缓冲液进行研磨，然后过4层纱布即得滤液，接种时加入少量60目的石英砂，用手指蘸取少量接种液，在烟草叶片正面轻轻摩擦，力度掌握在刚刚能在叶面造成微伤口即可，每个处理8个平行样，2次重复，将接种后的植株放置在日光温室中培养。分别于接种病毒7、10和13 d后按照烟草病害分级及调查方法(YC/T 39—1996)进行调查，计算病情指数。

病情指数计算公式：

式中,X为病情指数，Ni为各级病叶数，i为相对级数，N为调查总叶数。

1.2.2烟草花叶病毒含量测定。TMV接种后，分别于5、6、7、8、9 d取不同处理的烟草叶片，用液氮进行研磨匀质后，称取0.2 g，利用ELISA试剂盒(上海酶联生物)测定TMV含量。

1.2.3酶活性测定。TMV接种后，分别于0、2、4、6、8、10 d取不同处理的烟草叶片，用液氮研磨成粉末状态，称取1 g，加入各自待测酶的缓冲液研磨匀质后，离心(12 000 r/min，20 min，4 ℃)，上清液测定酶活性。按照宋凤鸣等[5]的方法测定超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性,参照Koch等[6]方法测定脂氧酶(Lipoxygenase，LOX)活性。

1.2.4RNA 提取和qRT-PCR测定相关基因的表达。B2处理后，在24、48、72 h 取不同处理的烟草叶片，用液氮处理后，保存在-80 ℃冰箱中，以备检测相关基因的表达。

总RNA按照 TRIzol试剂盒(Invitrogen,San Diego,CA)的用户手册提取，并根据Super Smart cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser) 的说明反转录cDNA。qRT-PCR在CFX Connect1M Real-Time System (Bio-Rad,USA) 根据 SYBR Green I Master mix kit (Takara)的说明进行。以β-actin为内参， 采用2-△△CT法计算相对表达水平。使用的基因特异性引物：对于NtCOI1,5′-TGCTTGACCGAGAGGAGAGA-3′ 和5′-CGCCCGACATAACTGAGACC-3′; 对于acidicPR-1,5′-GTCCATACTAATTGAAACGACCTAC-3′和 5′-CCACTTCAGAGGATTACATATATAGTAC-3′; 对于basicPR-1,5′-TTTTGGTGGTATTATGGAGGTGTG-3′和 5′-ACAATTAACTGCCGTTGACTCATC-3′; 对于NtRab11,5′-GACATCAACGGAAAGGAGGTTA-3′ 和 5′-GCTCCAACTGCACTCCTATAAT-3′；以β-actin(5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′ 和 5′-GGTGCAACGACCTTAATCTTCAT-3′) 用作内部对照。

1.3 数据分析采用Microsoft Excel 2010进行数据分析，结果用平均值±标准偏差来表示。

2 结果与分析

2.1 新合成化合物B2抑制感染烟草花叶病毒的效果从接种病毒后7、10和13 d的调查结果看出，用新合成化合物B2处理后的烟草，与清水(空白对照)相比，病情指数明显降低。由表1可知，以接种病毒后10 d调查结果为例，B2和茉莉酸甲酯处理后，病情指数明显小于清水处理，清水处理后的病情指数为 47.22；新合成化合物B2处理后，病情指数为20.39，茉莉酸甲酯处理后，病情指数为24.31，表明茉莉酸甲酯和B2可显著抑制烟草植株感染TMV。茉莉酸甲酯与B2处理后的病情指数无明显区别，但B2处理后抑制TMV感染效果略优于茉莉酸甲酯的处理效果。

表1 新合成化合物B2对烟草抗烟草花叶病毒的影响

2.2 B2对TMV的抑制效果通过采用间接ELISA法测定TMV的结果显示(图2)，用B2处理的烟草在接种TMV病毒5 d后，处理组的OD492为2.84，而对照组的OD492为9.76，之后对照组的OD492迅速上升，9 d后对照组的OD492达到处理组的2.8倍，5 ～ 9 d的检测结果显示，对照组与B2处理组均达显著差异。ELISA法的测定结果证明了新合成化合物B2对TMV侵染烟草的抑制效果。

图2 新合成化合物B2对TMV侵染烟草的抑制作用

2.3 B2处理后接种叶片中SOD和LOX活性变化由图3可知，B2处理后，烟草叶片中SOD活性迅速增加，且显著高于对照组。处理组和对照组中SOD活性的峰值均出现在B2处理2 d后，之后缓慢降低。

图3 B2处理后接种叶片SOD活性变化

由图4可知，对照组的脂氧酶活性在接种TMV后无明显变化，而B2处理组的脂氧酶活性在接种TMV后迅速升高，在接种病毒第2天时达到峰值，其活性为4.3 μg/(mg·h)，是对照组的4.8倍。之后，第4天开始处理组的脂氧酶活性有所降低，但均高于对照组。

图4 B2处理后接种叶LOX活性变化

2.4 B2处理对NtRab11基因表达量的影响研究发现,作为水稻中茉莉酸介导的关键基因，OsRab11和茉莉酸信号途径中的OsOPR8基因有互作效应，水稻中的OsRab11基因可通过调节茉莉酸生物合成作用于茉莉酸信号通道[7]。由图5可知，B2处理2 h后，NtRab11基因的表达量有明显的上调趋势，在6 h时，NtRab11基因的相对表达量为空白对照的6.2倍，之后，NtRab11的相对表达量缓慢降低，在12 h时，相对表达量为空白对照的4.0倍。

图5 B2处理对NtRab11的相对表达量的影响

2.5 B2处理后COI1、PR-1a和PR-1b的相对表达量的变化由图6可知，经B2处理后，随着诱抗时间的增加，茉莉酸信号通路中的关键基因COI1、植物抗病基因介导的系统抗性中的标志基因PR-1a和PR-1b的表达量均表现出增加趋势。COI1相对表达量稳步提高，在72 h时达到4.8倍。PR-1a和PR-1b基因的表达量与对照相比均有提高，且随着诱抗时间的增加而提高，在72 h时PR-1a和PR-1b基因的相对表达量为空白对照的5.2和3.1倍。

图6 B2处理后COI1、PR-1a和PR-1b 的相对表达量

3 结论与讨论

烟草花叶病毒为RNA病毒，可侵染许多植物，尤其对烟草及茄科植物的生产带来了极大的危害。该试验主要研究了新合成的化合物——茉莉酸甲酯类似物B2(500 mg/L)对烟草花叶病毒侵染烟草的抑制效果及相关诱导抗病机理。结果显示，施用B2，能显著降低烟草的病情指数。相关机理研究表明B2处理后，烟草中的SOD活性和LOX活性与对照相比均有提高，且茉莉酸信号途径的NtRab11基因、茉莉酸信号通路中的受体蛋白关键基因COI1、植物抗病基因PR-1a和PR-1b的表达均有显著提高。

Fodor等[8]研究表明，烟草植株的抗性提高时，SOD的活性增加，因此，认为SOD活性在烟草植株的抗病过程中起重要作用。该试验中，B2处理样品与对照相比，SOD活性显著提高，表明茉莉酸甲酯类似物B2能有效提高烟草植株内的SOD活性。Aranda等[9]研究黄瓜子叶中黄瓜花叶病毒的复制时，黄瓜子叶相关LOX的基因表达被抑制，说明可能LOX对黄瓜花叶病毒的复制有抑制效果。该研究中茉莉酸甲酯类似物B2能明显诱导烟草中的LOX活性，且降低处理样品中的TMV含量。以上结果表明用B2处理，LOX的活性增加，且LOX可能对TMV的积累有不利作用。

Rab11基因影响植物的生长发育通过调节细胞内的囊状小泡的运输[10]，豆科植物中根毛的发育[11]，拟南芥中花粉的发育均可受该基因的影响[12]。经过MeJA处理之后，本氏烟中Rab11有所上调，表明该基因对于茉莉酸甲酯的反应具有一定的相关性。作为植物体内的一种内源生长调节物质，茉莉酸能够诱导激发植物体内的系统性抗性，研究显示水稻 OsRab11是MeJA介导的防卫信号所必需的基因，酵母筛库的试验表明，茉莉酸途径中的OsOPR8基因和水稻OsRab11基因有互作效应，OsRab11基因能够调节茉莉酸信号途径，且拟南芥植株中超表达OsRab11能够提高丁香假单孢菌的侵染抗性[7]。据此推测，B2处理后的烟草植株提高TMV的侵染抗性可能是因为Rab11基因的高表达增强了与茉莉酸途径中的OsOPR8基因相互作用，提高了茉莉酸的生物合成，从而增强了茉莉酸介导的系统性防御反应，提高了TMV侵染的抑制效果。具体机理还需要进一步探究。

综上所述，新合成的茉莉酸甲酯类似物B2处理烟草植株后，促进SOD、LOX的活性，抑制TMV在烟草植株中的积累，且茉莉酸信号通路中的相关基因和植物抗病相关基因NtRab11、COI1、PR-1a和PR-1b的相对表达量都有所提高。以上结果表明，B2对TMV侵染烟草植株有抑制效果。