猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立及应用

杨 俊，聂福平，王 昱，史梅梅，谢晓倩，王国民，李贤良，吴 蕊，张 欢，唐昌杰，李应国

(重庆海关技术中心，重庆 400020)

猪瘟，又被称为古典猪瘟(classical swine fever,CSF)、烂肠瘟，是一种感染了猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)而引起的高度接触性的急性传染病。该病流行广泛，发病率和死亡率高，是世界动物卫生组织(OIE)规定的通报类传染病[1]，在我国《进境动物检疫疫病名录》中列为一类传染病。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)是一种新型的等温核酸扩增技术，在较低温度下，15～30 min即可完成检测，具有反应条件温和、扩增效率高的优点，并且通过在反应体系中加入荧光探针可实现对扩增对象的实时检测。该研究基于RPA检测技术，针对CSFV基因组的5′端非编码区高度保守序列设计并合成了特异性的引物和exo探针，成功建立了实时荧光重组酶聚合酶扩增检测猪瘟病毒的方法，以期为猪瘟快速诊断提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1毒株。猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)疫苗株(石门株)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis，TGEV)(IND型)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)(AP76)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)(SH0165)、猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)(168-L)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)(BIAH-001)、猪圆环病毒2型(porcine cirovirus Type 2，PCV-2)(PM167)、猪水疱病病毒(swine vesieular virus，SVDV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)疫苗株(cp99)，由重庆海关技术中心动物检疫实验室保存。

1.1.2主要试剂。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit、Premix TaqTM、DL2000 DNA Marker、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit、PMDTM19-T Vector Cloning kit、DH5a感受态细胞、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification kit,购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；Twist Amp exo kit,购自英国Twist Dx 公司。

1.1.3主要仪器。Genie Ⅱ等温扩增荧光检测系统(英国OptiGene)；NanoDrop oneC 微量核酸蛋白浓度测定仪(美国Thermo Scientific);Veriti 96多功能梯度PCR仪器(美国Applied Biosystems);GelDoc XR+凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad);Centrifuge 5417R高速离心机(德国Eppendorf)。

1.2 试验方法

1.2.1引物和探针。CSFV 5′NTR由360～374个碱基组成，具有高度保守性。该研究选择该部分序列作为扩增对象，从NCBI下载CSFV基因组5′NTR序列进行分析，参考Twist Amp exo kit关于RPA引物和exo探针的设计要求，利用Primer premier 5软件设计RPA引物和exo探针，委托TAKARA公司合成。引物及探针序列如下：CSFV-RPA-F：5′-GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGAC-3′；CSFV-RPA-R：5′-CTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGA-3′；CSFV-RPA-P：5′-GTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGTTCTAAGT(FAM)-(THF)CT(BHQ1)-GAGTACAGGACAG-(P)-3′；其中，FAM为羧基荧光素，THF为四氢呋喃，BHQ1为黑洞猝灭剂 1，P为磷酸盐基团。

1.2.2病毒核酸的提取。使用TaKaRa公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit试剂盒分别提取CSFV、TGEV、PRRSV、SVDV的RNA以及PCR-2和PPV的DNA，使用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取APP、HPS和Mhp的DNA，以上操作过程均在生物安全柜中进行。RNA提取完成后立即使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit反转录合成第一链cDNA。cDNA和DNA均置-20 ℃冷冻保存备用。

1.2.3质粒标准品的构建。CSFV核酸RNA提取后立即进行反转录合成cDNA，以该cDNA作为模板，用设计的CSFV RPA引物(CSFV-RPA-F/CSFV-RPA-R)进行PCR反应。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定得到预期大小的扩增子并回收，连接到PMDTM-19T载体，转化到DH5α感受态细胞，从阳性克隆中提取质粒，利用紫外可见核酸蛋白分析仪(NanoDrop oneC) 测定其浓度，根据公式：拷贝数=[浓度(ng/μL)×6.02×1023×10-9]/(DNA长度×660)计算质粒拷贝数，-20 ℃保存备用。

1.2.4CSFV实时荧光RPA反应条件的优化。Twist Amp exo kit提供的反应管中已经预混了各种酶，按其说明书要求，向反应管中加入Rehy-dration Buffer 29.5 μL、ddH2O 8.2 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL，10 μmol/L探针0.6 μL，模板5 μL，向反应管的盖子中加入Mg2+2.5 μL，盖上盖，瞬时离心后立即将反应管置于OptiGene Genie Ⅱ等温扩增荧光检测系统，分别在35、37、39、40、42 ℃下反应40 min，根据扩增曲线，确定最适反应温度和最佳反应时间。

1.2.5CSFV实时荧光RPA特异性试验。RPA引物长度为30～35 nt，exo探针长度为46～52 nt，比普通PCR和荧光定量PCR的引物、探针都更长，理论上具有更高的特异性。为了验证CSFV实时荧光RPA的特异性，选择CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、PCV-2、SVDV、PPV的cDNA或DNA作为模板，以无菌去离子水作为阴性对照，在确定的最佳反应条件下进行检测，评价方法的特异性。

1.2.6CSFV实时荧光RPA敏感性试验。为测试CSFV实时荧光RPA检测方法的敏感性，将扩增片段转化入DH5α感受态细胞中，提取质粒并测定浓度，计算拷贝数作为标准品。将质粒标准品进行10倍连续稀释，取各个稀释度的质粒分别作为模板，在最佳反应条件下进行RPA扩增，确定该方法的最低检出限。

1.2.7临床样品检测。从重庆某养猪场采集20份血清样本、5份淋巴结样本、5份肝脏样本和3份肾脏样本，分别提取核酸，用建立的CSFV实时荧光RPA方法进行猪瘟病毒核酸检测，以评价其在实际检测中的效果，同时，采用国家标准GB/T 16551—2020对所有样本进行猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测，比较2种方法的符合性。

2 结果与分析

2.1 标准品的制备将CSFV扩增片段转化入DH5α感受态细胞中，提取含有CSFV核酸片段的重组质粒进行测序，将测序结果提交NCBI进行BLAST比对，结果显示，插入的核酸片段大小为124 bp，与预期一致，与CSFV具有高度同源性，相似度达到99%以上。经紫外可见核酸蛋白分析仪测定，该质粒浓度为25.5 ng/μL，A260/A280值为1.87，计算出拷贝数为8.3×109copies/μL。

2.2 CSFV实时荧光RPA反应条件的优化将配制好的反应体系分别在35、37、39、40、42 ℃下进行RPA反应，检测荧光强度。试验结果显示(图1)，随着反应温度升高，检测到荧光信号所需的时间更短，且最终的荧光强度也更高，但当反应温度超过39 ℃后，荧光信号反而出现下降；随着时间延伸，荧光信号不断积累，但30 min以后，荧光强度不再升高，说明反应进入平台期。综上，CSFV实时荧光RPA最佳反应温度和反应时间分别为39 ℃、30 min。

图1 猪瘟病毒实时荧光RPA检测方法的优化

2.3 CSFV实时荧光RPA特异性试验为了验证CSFV实时荧光RPA检测方法的特异性，选择CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、SVDV、PPV、PCV-2等猪场常见的猪病作为研究对象，提取核酸后分别用建立的实时荧光RPA方法进行扩增，结果见图2。随着反应时间的进行，CSFV阳性样品在反应开始6 min后荧光强度逐渐升高，相比之下，其他样本和阴性对照在30 min之内都无荧光信号产生，说明该方法对上述除CSFV之外的常见猪病病原无反应，特异性良好。

注：1.猪瘟病毒;2～10.猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪水疱病病毒、猪细小病毒、阴性对照

2.4 CSFV实时荧光RPA敏感性试验经测定CSFV重组质粒浓度为8.3×109copies/μL，将该质粒进行连续10倍稀释，取每个稀释度的质粒5 μL分别作为模板，用建立的实时荧光RPA方法进行检测，结果显示(图3)，随着质粒浓度的降低，能够检测到荧光信号的时间也随之延后，而且最终的荧光信号强度也相应降低，当CSFV重组质粒浓度降至8.3×102copies/μL 以下，检测不到荧光信号，因此，该CSFV实时荧光RPA方法最低检出限为8.3×102copies/μL，灵敏度较好。

注:1～6为8.3×107～8.3×102 copies/μL

2.5 临床样品检测从重庆某养猪场采集了33份样本，同时使用建立的CSFV实时荧光RPA方法和国家标准方法对这些样本进行猪瘟病毒核酸检测，结果显示(表2)，RPA方法从20份血清样本中检出2份CSFV核酸阳性，从5份淋巴结样本中检出2份CSFV核酸阳性，从5份肝脏样本中检出1份CSFV核酸阳性，从3份肾脏样本中检出1份CSFV核酸阳性，与国家标准的实时荧光RT-PCR检测结果完全一致。

表2 猪瘟病毒临床样本检测结果

3 讨论与结论

我国于1954年研制出猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)，并大规模地进行疫苗接种，现成功控制了该病的大流行，但目前猪瘟仍呈散发流行的新态势，增大了猪瘟防控的难度。此外，家猪和野猪都是CSFV的宿主，野猪可能在CSF的流行和传播中发挥重要作用。即便某地区的家猪中已经根除了CSF，如果同地区的野猪群中仍有该病流行，仍有可能将病毒传入养殖场中[2]。

快速可靠的诊断对于及时实施CSFV控制措施至关重要，由于目前猪瘟常以非典型形式出现，且症状与猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、猪细小病毒等相似，因此，需要进行实验室检测来确诊该病。CSFV的实验室检测方法主要有RT-PCR试验[3-11]，该技术目前已比较成熟，有许多商品化的CSFV核酸检测试剂盒可供选择。为了实现CSF的现场检测，有研究人员开发出了便携RT-PCR系统[12]、引物-探针能量转移 RT-qPCR系统[13-14]等。为了替代PCR的热循环模式还诞生了很多等温扩增方法，如恒温隔绝式RT-qPCR[15]、环介导等温扩增 (LAMP)[16-21]和RPA；CSFV也可以通过传代细胞系，如猪肾细胞系PK15或SK6上培养分离而得到确诊，但病毒分离对环境洁净度要求极高，需要非常熟练的试验人员来操作，容易发生污染导致试验失败；此外，还可以使用血清学的方法来诊断CSFV，如荧光抗体或免疫过氧化物酶测定法等[22-23]，但有研究指出，同属的牛病毒性腹泻病毒-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea-mucosal dicease virus,BVDB)和绵羊边界病病毒(border disease virus,BVD)在抗原性上与CSFV存在交叉反应，这2种病毒都能够感染猪，而且抗体水平通常比CSF高[24]。因此，血清学的方法在检测猪瘟病毒方面存在敏感性低、特异性差的问题，仅适用于发病猪的检测[25]。

RPA最早由Niall Armes于2006年提出，该技术包含3种核心蛋白、重组酶(T4 UvsX protein)、重组酶加载因子(T4 UvsY)和单链结合蛋白(T4 gp32)。重组酶在重组酶加载因子的协助下，寻找并侵入同源序列形成D-环结构，启动链置换反应，DNA聚合酶(Bsu或Sau)则在引物的3-OH端开始合成一条与父链完全一样的子链，最后，实现类似PCR结果的目标DNA指数扩增。相比PCR技术，RPA的技术优势主要体现在：①反应效率高，节省时间。RPA反应在恒温条件下进行，明显减少循环加温和降温的等待时间；反应具有高度的并行性，一条链上可以同时进行多个聚合酶的扩增。②对仪器设备的要求低，适合田间、基层实验室等开展核酸检测和研究。相比其他等温扩增技术，如基于核酸序列的扩增(NASBA)、信号介导的核酸扩增技术(SMART)、依赖解旋酶核酸扩增(HDA)、环介导等温扩增(LAMP)等，RPA同样优势明显，具体表现在：①对核酸类型无要求，可以实现对DNA或RNA信号的放大，而NASBA只能扩增RNA。②容易掌握，仅需设计一对稍长的特异引物(30～35 mer)即可进行RPA试验，也可以再设计一条带荧光标记的探针实现实时荧光检测；而LAMP 技术需要多对引物，设计难度高，要筛选出合适的引物需要耗费大量工作。③RPA的产物是双链DNA分子，可以利用许多PCR平台成熟的试剂和技术进行分析；LAMP的扩增产物是一些大小不等的片段,对下游技术限制较大，无法进行直接克隆和测序，只能用于判断目的基因的存在，这也是LAMP方法最大的局限性。正因为RPA的上述优点，该技术自问世以来深受广大科研工作者喜爱，被称为有望替代PCR的新一代型核酸检测技术，在疫病诊断方面得到广泛应用。杨俊等[26]建立了绵羊痘病毒和山羊痘病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法，灵敏度高，特异性强，为绵羊痘病毒和山羊痘病毒的鉴别诊断提供了技术支持；Abd等[27]基于RPA技术，建立了可以检测所有的7个口蹄疫病毒血清型的方法；Wang等[28]建立了PCV2实时荧光RPA检测方法，灵敏度比普通PCR高10倍；王建昌等[29]针对非洲猪瘟病毒VP72保守基因序列建立的RPA检测方法，在38 ℃恒温反应30 min即可获得检测结果。

该研究在开展过程中也发现RPA存在的不足，如扩增片段不能太长，超过500 bp则会明显降低其扩增效率，甚至无法扩增出目的片段；其次，由于其所需反应温度温和、反应速率快，往往在加样过程中扩增就已经开始，无法控制扩增起始时间，暂时无法实现荧光PCR的定量检测功能，但对于定性检测无任何影响。

该研究基于RPA检测技术，针对CSFV 5′UTR高度保守的序列，设计了特异性引物和探针，建立了实时荧光RPA检测方法，实现了CSFV的快速诊断。该方法与APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV、SVDV、TGEV、PPV无交叉反应，检出限达到8.3×102copies/μL，特异性好，敏感性高，为CSFV的快速、准确诊断提供了强有力的工具。