茶叶中掺杂大米成分实时荧光PCR检测方法的建立和应用

黄迎波，黄才新，江 杰，袁小雅，朱金国

(长沙海关，湖南长沙 410004)

近年来随着茶叶需求量不断增长，茶叶消费市场以次充好、假冒伪劣甚至掺杂掺假时有发生，给正常的茶叶消费和进出口贸易造成不良影响[1-2]。其中茶叶中掺假问题越来越严重，一些不法商贩为获得高利润在茶叶中掺杂各种谷类物质，于茶叶初制或加工过程中加入，其目的是将茶叶重新造型，促成条状；或使粗老茶、回笼茶扭成条，增进重实感；或是利用谷物淀粉糊的黏性，掺入一些沙土、木灰、煤屑等；或上述掺伪兼而有之[3-4]。

随着科学技术的发展，分子生物学鉴定技术逐渐渗透到各个生物领域，特别是PCR技术具有快速、灵敏、特异性高的特点，已广泛应用于食品、饲料中外源成分的鉴定[2-12]。目前，鲜见应用该技术检测茶叶中掺杂大米成分的报道。该研究根据大米内源PLD基因建立茶叶中掺杂大米的实时荧光PCR检测方法，以期能够快速、准确地检测出茶叶中掺杂的大米成分。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试材。36份茶叶抽取自茶叶生产企业，从市场采购的大米作为阳性对照、金银花作为阴性对照。

1.1.2试剂。PCR试剂购置Promega公司，植物DNA提取试剂盒购置天根公司。大米PLD内源基因实时荧光PCR引物探针见表1。

1.1.3仪器。LightCycler 480Ⅱ(96)荧光定量PCR仪，NANOVUE微量分光光度计，Retsch GM 200粉碎破碎机。

1.2 试验方法

1.2.1样品前处理。

(1)手工研磨法。随机选取4份茶叶(编号分别为073、513、514、519)和含10%大米成分的茶叶，分别称取约1 g于研钵中，加入液氮迅速研磨成茶粉。

(2)机器打碎法。随机选取4份茶叶(编号分别为073、513、514、519)和含10%大米成分的茶叶，分别称取约100 g，用Retsch GM 200粉碎破碎机进行打碎，直至茶叶打成粉末状。

1.2.2基因组DNA的提取。采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取茶叶、大米和金银花中的DNA；同时将不同质量的大米磨成粉末状掺入到茶叶中，设置4个梯度，分别为10.0%、3.0%、1.0%和0.1%，采用机器打碎法粉碎样品，再用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA；提取的DNA在NANOVUE微量分光光度计上测定基因组DNA的浓度。

1.2.3实时荧光PCR检测。20 μL反应体系：Promega GoTaqqPCR Master Mix(2×)10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、10 μmol/L的荧光探针1 μL、Rnase-free water 2 μL，最后加入DNA模板5 μL。各样品设一个平行反应，并设置阴性、阳性和空白对照。反应程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。使用Lightcycler 480 Ⅱ 荧光定量PCR仪进行实时荧光PCR扩增并观察记录结果。

1.2.4方法的特异性和灵敏度。选取未含大米成分的茶叶样品、金银花和含10%大米成分的茶叶样品进行实时荧光PCR扩增，用大米DNA作阳性对照，检测引物探针特异性。用含10.0%、3.0%、1.0%和0.1%大米成分的茶叶样品进行灵敏度试验。

1.2.5模拟生产污染因素。根据茶叶生产过程中可能存在污染的情况，对可能涉及污染的环节进行模拟试验。用粉碎过大米的破碎机杯体不经洗涤直接粉碎未掺大米成分的茶叶样品，用粉碎过掺杂大米成分茶叶的破碎机配套杯体不经洗涤直接粉碎未掺大米成分的茶叶样品，再将这2个样品与阴性茶叶样品、掺杂0.1%大米的茶叶样品、大米样品一起进行荧光定量PCR检测。

1.2.6茶叶抽检。从30家茶叶企业抽取36批次产品，包括绿茶、红茶、黑茶、白茶、眉茶、茯砖等种类，开展茶叶掺杂使假专项检测；基于该研究所建立的大米内源PLD基因实时荧光PCR检测方法对茶叶进行掺杂大米成分检验。

2 结果与分析

2.1 不同前处理方法提取DNA的浓度茶叶中掺杂大米成分的量对检测结果的判定有直接影响，所以前处理样品的取样量十分关键。该研究采用2种常用方法对随机选取的4份茶叶(编号分别为073、513、514、519)和含10%大米成分的茶叶进行前处理和DNA浓度比较分析，手工研磨法取样量少，提取的DNA浓度较低；机器打碎法取样量大，提取的DNA浓度较高，具体结果见表2。

表2 机器打碎和手工研磨方法提取茶叶样本基因组DNA的浓度

2.2 PLD基因实时荧光PCR扩增的特异性和灵敏度用2种前处理方法(手工研磨法、机器打碎法)粉碎含10%大米成分的茶叶样品都有明显的扩增曲线，破碎机打碎法的扩增曲线更显著(图1)。用未含大米成分的茶叶样品、金银花和含10%大米成分的茶叶样品进行实时荧光PCR扩增结果见图2，可见引物和探针仅对大米阳性对照和含10%大米成分的茶叶扩增阳性，有明显的“S”型扩增曲线，对未含大米成分的茶叶和金银花扩增阴性，表明该引物和探针特异好。

图1 2种方法前处理含10%大米茶叶样品基因组DNA的实时荧光PCR扩增

图2 实时荧光PCR引物探针特异性试验扩增曲线

将含10.0%、3.0%、1.0%和0.1%大米成分的茶叶样品提取DNA后进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线见图3。从图3可以看出，含10.0%、3.0%、1.0%和0.1%大米的茶叶基因组DNA都有显著的“S”型扩增曲线，因此实时荧光PCR的灵敏度能达到0.1%。

图3 实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线

2.3 生产污染对检测结果的影响模拟生产污染的2个样品与掺杂0.1%大米的茶叶样品同时进行实时荧光定量PCR检测，结果见图4。从图4可以看出，用粉碎过掺杂大米成分茶叶的破碎机配套杯体不经洗涤直接粉碎的阴性茶叶样品无扩增曲线，用粉碎过大米的破碎机杯体不经洗涤直接粉碎的阴性茶叶样品在35个循环以后有扩增，而掺杂0.1%大米的茶叶样品在32个循环左右出现扩增，表明生产污染对使用该方法检测茶叶掺杂大米成分试验结果基本无影响。

图4 生产污染模拟试验实时荧光PCR扩增曲线

2.4 茶叶抽检结果对30家茶叶企业抽检的36批茶叶样品进行实时荧光定量PCR检测，其中6批样品检出大米PLD基因且均为绿茶，检出率为17%(表3)；Ct值均在31以下，分别来自5家企业。

表3 茶叶抽检结果汇总

3 小结与讨论

该研究建立了基于PLD基因检测茶叶中是否掺杂大米成分的实时荧光PCR检测方法，研究了方法的特异性和灵敏度，模拟生产污染环节排除假阳性可能。使用该方法时，仅直接观察实时荧光扩增曲线图，2 h就可以准确检测某茶叶样品是否掺杂大米成分，灵敏度能达到0.1%。该方法具有较高的检测灵敏度和准确度，操作简便，不容易出现假阳性，可作为茶叶样品中掺杂大米成分的快速检测方法，在茶叶掺杂谷物类物质检测把关上具有较好的应用前景。

利用所建立的方法对36份茶叶样品进行了检测，发现5家企业的6批次茶叶产品都不同程度检出含有大米成分，检出率为17%。经对检出原因进行调查分析，6批次产品中，有1批次茶叶由于生产企业已经销售完毕，无法实现进一步追溯调查，有4批次茶叶原料使用了珠茶原料或珠茶副产品，不属于违规行为(食品安全标准中明确珠茶在整型过程中可依据传统工艺添加糯米糊)；有1批次茶叶是由于原料供应商为了塑形在加工过程中违规添加糯米糊。向绿茶(眉茶)里混入加工过的大米成分的违规行为，在今后的茶叶掺杂使假专项检测活动中应重点关注。